病原微生物檢驗(yàn)實(shí)習(xí)總結(jié)

病原微生物檢驗(yàn)實(shí)習(xí)總結(jié)

大三下學(xué)期5月份，我們動(dòng)物檢疫專業(yè)的同學(xué)開始了為期2個(gè)多月的教學(xué)實(shí)習(xí)，在眾多輔導(dǎo)老師之中，我有幸跟隨我校動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防系的趙宇軍教授進(jìn)行學(xué)習(xí)。實(shí)習(xí)的地點(diǎn)就在我校動(dòng)科樓的微生物實(shí)驗(yàn)室，以前我們?cè)�在這里上過(guò)實(shí)驗(yàn)課，所以并不陌生。這次大家來(lái)到實(shí)驗(yàn)室為自行選擇課題進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作，我對(duì)世界聞名的金黃色葡萄球菌非常感興趣，在老師的帶領(lǐng)下進(jìn)行了相關(guān)食物中該菌的檢驗(yàn)。下面我們來(lái)回顧這次實(shí)驗(yàn)。

一、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：食品中金黃葡萄球菌的檢測(cè)方法

金黃色葡萄球菌是一種引起人類和動(dòng)物化膿感染的重要致病菌，也是造成人類食物中毒的常見致病菌之一。本菌廣泛分布于自然界，如空氣、土壤、水及其它環(huán)境中。在人類和動(dòng)物的皮膚及外界相通的腔道中，也經(jīng)常有本菌存在。據(jù)報(bào)導(dǎo)，在正常人群中的帶菌率可達(dá)30%~80%，其中皮膚帶菌率為8~22%，鼻腔和咽喉部等上呼吸道的帶菌率在40~50%以上，因此其可通過(guò)各種途徑和方式，尤其是經(jīng)工作人員的手和上呼吸道而污染食品。由于致病金黃葡萄球菌能產(chǎn)生腸毒素，故一旦細(xì)菌污染食品，并在合適的溫度環(huán)境下，細(xì)菌可以大量繁殖并產(chǎn)生腸毒素，從而引起消費(fèi)者食物中毒。

由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒，在世界各國(guó)都極為普遍。特別是在北美及歐洲等地區(qū)發(fā)病率更高。在上述這些國(guó)家中，每年有金黃色葡萄球菌引起的食物中毒病例，僅次于沙門氏菌，而在細(xì)菌性食物中毒病例排到第2~3位，有此而造成的經(jīng)濟(jì)損失也相當(dāng)慘重，在我國(guó)由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒病例也時(shí)有報(bào)導(dǎo)，所以目前世界各國(guó)都把金黃色葡萄球菌列為食品衛(wèi)生的法定檢測(cè)項(xiàng)目。

我國(guó)對(duì)金黃色葡萄球菌目前采用的方法是以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB.4789-10-84及檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN.0172-92作為依據(jù)。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程獲得最終結(jié)果須時(shí)5天左右，既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，并造成貨物積壓，也影響貨物的及時(shí)出運(yùn)，并使貨主的倉(cāng)儲(chǔ)成本提高，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。多年來(lái)很多食品微生物實(shí)驗(yàn)室都在探索和尋找一些準(zhǔn)確性高，并快速的檢測(cè)方法，最近我們分別從美國(guó)3M公司和法國(guó)生物梅里埃公司獲得兩種快速檢測(cè)致病性金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基，其名稱為：

①PetrifilmRSA.CountPlate（由美國(guó)3M公司研制生產(chǎn)），是一種薄膜型快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)平板。

②Baird-parker+RPFAgar.（由法國(guó)生物梅里埃公司研制生產(chǎn)的用Baird-Parker瓊脂加免血漿纖維蛋白原的金黃色葡萄球菌檢測(cè)計(jì)數(shù)平板）。

二、實(shí)驗(yàn)原理：

Petrifilm.RSA.測(cè)試薄膜是由二部分組成。第一部分是由黃金色葡萄球菌培養(yǎng)基片，此培養(yǎng)基中含有經(jīng)修正的Barid-Parker，營(yíng)養(yǎng)成分加上以冷水可溶解的膠質(zhì)。第二部分是一種耐熱核酸酶（TNase）反應(yīng)片，含有DNA及甲苯胺蘭(ToluidineBlue-O)及四唑指示劑(Tetraeolium)。此指示劑有助于菌落的計(jì)數(shù)及確定葡萄球菌耐熱核酸酶的存在。

耐熱去氧核糖核酸（deoxyribonulcasDnase）為產(chǎn)毒金葡菌之典型特征，此酶非常耐熱，在100℃加熱30min，不易喪失活性，在130℃之下，其D值為16.6min，此酶之分子量為16800，等電點(diǎn)PH為9.6,耐熱去氧核糖酸與檢測(cè)血漿凝固酶相似，是一種鑒定金黃色葡萄球菌的方法，在Petrifilm.RSA檢測(cè)片上，耐熱DNA酶反應(yīng)看起來(lái)，呈粉紅色環(huán)帶包圍著一個(gè)紅色或蘭色的菌落。

Petrifilm.RSA檢測(cè)片，必須與Peyrifilm耐熱核酸酶反應(yīng)片一起使用，單獨(dú)使用將不會(huì)顯示菌落，因?yàn)榫哂休o助計(jì)數(shù)菌落的指示劑是在反應(yīng)片上，而不是在Petrifilm.RSA檢測(cè)片上。

Baird-parker+RPFagar，這一培養(yǎng)基中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，其中以氯化鋰代替亞碲酸鉀，使菌落顏色呈黑色，RPF補(bǔ)充有兔血漿和牛纖維蛋白原，以便檢測(cè)凝固酶活力，胰酶可以抑制全部或部分圍繞凝固酶陽(yáng)性菌落周圍沉淀暈環(huán)纖維蛋白的溶解，因此凡存在血漿凝固酶陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌，將在培養(yǎng)基中呈現(xiàn)有暈環(huán)的黑色菌落，即可確認(rèn)，并作計(jì)數(shù)。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

材料和方法：

本次實(shí)驗(yàn)采用以下3種試劑：

1.美國(guó)3M公司提供的Petrifilm.Rapid.S.aureusCountPlate.2.法國(guó)生物~梅里埃公司提供的Baird-Parker+RPFagar.3.實(shí)驗(yàn)室自配Baird-Park瓊脂（英國(guó)Oxoid）及新鮮兔血漿。

菌種來(lái)自美國(guó)菌種保存中心（AmericaTyPCultureCollection）。金黃色葡萄球菌共10株菌株，其菌號(hào)分別為：

ATCC27661ATCC27664ATCC13565ATCC51704ATCC(K)12600ATCC(R)65389ATCC25923ATCC29213ATCC8095ATCC12598

非金黃色葡萄球菌菌種5株，其菌號(hào)分別為：

ATCC51813（大腸桿菌）、ATCC624（無(wú)乳鏈球菌）、ATCC51816（陰溝腸桿菌）、ATCC6051（枯草桿菌）、ATCC49214（腸炎沙門氏菌）、自然食品檢樣，任意購(gòu)自市場(chǎng)。本次實(shí)驗(yàn)是以同一測(cè)試樣品經(jīng)均質(zhì)并通過(guò)無(wú)菌生理鹽水作10倍遞增稀釋后取1至2個(gè)稀釋度同時(shí)接種上述三種培養(yǎng)基作平行實(shí)驗(yàn)，在取得最終結(jié)果后相互進(jìn)行比對(duì)。

上述三種培養(yǎng)基的接種方法是按生產(chǎn)商所提供的使用說(shuō)明進(jìn)行操作，另外Baird-ParkerAgar培養(yǎng)基是按SN0172-92標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。

A、本次實(shí)驗(yàn)共測(cè)試已知標(biāo)準(zhǔn)菌種共15株，其中葡萄球菌10株，其他菌種5株（包括大腸桿菌、陰溝腸桿菌、腸炎沙門氏菌、枯草桿菌和無(wú)乳鏈球菌）。B、測(cè)試自然食品檢樣共101只（其中包括肉11只、肉類14只、水產(chǎn)品17只、牛奶25只、蔬菜22只、豆制品12只）。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

A、被檢菌種10株，金黃色葡萄球菌在三種培養(yǎng)基上都能檢出生長(zhǎng)情況良好，同一稀釋度的菌液，除個(gè)別菌株外在3種培養(yǎng)基計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果基本都在一個(gè)數(shù)量級(jí)上，無(wú)顯著差異。而5株非金黃色葡萄球菌的菌株在三種培養(yǎng)基上全部不能生長(zhǎng)。

B、自然食品檢樣共接種101只，每一檢樣同一稀釋濃度分別同時(shí)種三種培養(yǎng)基，最終共檢出金黃色葡萄球菌45只，占全部檢樣的44.5％，其中PetrifilmRSA檢出陽(yáng)性結(jié)果為42只，占全部陽(yáng)性檢樣的93.3％，Baird-Parker＋RPFAgar.檢出陽(yáng)性結(jié)果26只，占全部陽(yáng)性檢樣的57.7％。Baird-Parker.Agar檢出陽(yáng)性結(jié)果32只，占全部陽(yáng)性檢樣的71.1％。

五、實(shí)驗(yàn)討論

1.用15株標(biāo)準(zhǔn)菌在3種培養(yǎng)基中的檢測(cè)，10株金黃色葡萄球菌以同一濃度接種，結(jié)果生長(zhǎng)良好，其最終計(jì)數(shù)基本一致，定位在同一數(shù)量級(jí)，5株非金黃色葡萄球菌接種上述三種培養(yǎng)基全部不長(zhǎng)，說(shuō)明上述三種培養(yǎng)基對(duì)金黃色葡萄球菌選擇良好。

2.以101只自然樣品同一均質(zhì)稀釋液，同時(shí)接種三種培養(yǎng)基，從最終結(jié)果來(lái)看，對(duì)金黃色葡萄球菌的陽(yáng)性檢出率為44.5％

3.從檢測(cè)程序來(lái)年，Petrifilm.RSA及Baird-Parker＋RPF.Agar.都在樣品接種后28~30h觀察結(jié)果，并不必再做證實(shí)試驗(yàn)，而如以Baird-ParkerAgar檢測(cè)，須在接種后48h觀察平板，并挑取可疑菌落轉(zhuǎn)種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中，在經(jīng)18-24h后做血漿凝固酶或耐熱DNA酶試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)，最終計(jì)數(shù)，前后約須80h。

4.從本次試驗(yàn)中觀察，使用上述三種培養(yǎng)基對(duì)食品中金黃色葡萄球菌含量的直接計(jì)數(shù)檢測(cè)，其樣品接種液的含量擬控制在100個(gè)/ml以內(nèi)，比較容易分清并計(jì)數(shù)，如菌量過(guò)濃，則將會(huì)影響最后的讀數(shù)，因此對(duì)新送的被檢樣品，如在不了解污染的情況下一般必須要做2個(gè)以上的稀釋度，同時(shí)分別接種，才能獲得較為滿意的結(jié)果。

而在Baird-Parker＋RPFAgar及Baird-Parker.Agar接種時(shí)必須將1ml樣液作三只平板涂布（0.3、0.3、0.4ml）這樣就會(huì)造成手續(xù)繁瑣試劑消耗較大，但Baird-Parker.RPF.培養(yǎng)基也可以1ml樣液作傾注培養(yǎng)，并作計(jì)數(shù)。

5.在整個(gè)測(cè)試過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)，按使用說(shuō)明對(duì)Petrifilm.RSA.及Barid-Parker＋RPF.Agar，操作規(guī)定在接種24h后觀察結(jié)果，此時(shí)往往由于菌落長(zhǎng)得經(jīng)較小，特征瓜不明顯，但如果繼續(xù)放置一夜以后金葡萄菌落特征明顯，并可能會(huì)經(jīng)第一天觀察數(shù)量有所增加，這樣可以提高檢測(cè)結(jié)果的可信度。

6.由于對(duì)上述兩種培養(yǎng)基的試用期間我們尚未獲得供應(yīng)商的報(bào)價(jià)，故無(wú)法測(cè)算每一樣品的測(cè)試成本價(jià)格。但可以予計(jì)上述兩面種快速檢測(cè)培養(yǎng)基的耗材費(fèi)用要高于常規(guī)經(jīng)典方法（Baird-ParkerAgar）的費(fèi)用。

7.通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，我們感到使用美國(guó)3M公司生產(chǎn)的Petrifilm.RSAPlate培養(yǎng)基和法國(guó)生物－梅利埃公司生產(chǎn)的Baird-ParkerRPF.Agar培養(yǎng)基檢測(cè)中的金黃色葡萄球菌�？梢员饶壳俺Ｒ�(guī)檢測(cè)方法時(shí)間可縮短一半。并可以明顯節(jié)省大量人力。這完全符合實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)的要求，尤其是對(duì)基層較簡(jiǎn)陋的實(shí)驗(yàn)室條件中，更顯其使用方便的優(yōu)越性。

實(shí)習(xí)總結(jié)：通過(guò)這次嚴(yán)謹(jǐn)而生動(dòng)的實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)，為我們先前在教學(xué)中學(xué)習(xí)到的知道提供了一個(gè)實(shí)際的操作實(shí)施平臺(tái)，也為今后在這方面檢驗(yàn)技術(shù)的工作起到了指引作用。在過(guò)去的學(xué)習(xí)中，我們并不了解具體的病原微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)技術(shù)的具體流程，注意事項(xiàng)等等非常關(guān)鍵和必須的防御手段。通過(guò)上學(xué)期生產(chǎn)實(shí)習(xí)，使我們對(duì)以前所不熟知的問(wèn)題有了深入的認(rèn)識(shí)，也對(duì)目前的情況有所思考和感悟。在我看來(lái)，動(dòng)物檢疫人員在我國(guó)國(guó)民生活中起到了關(guān)鍵作用，民以食為天，沒有認(rèn)真負(fù)責(zé)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，將給社會(huì)帶來(lái)巨大的飲食災(zāi)難，為此，我感到非常自豪和驕傲。在今后的工作學(xué)習(xí)中，我將一如既往的認(rèn)真下去，無(wú)愧自己的職責(zé)和稱號(hào)。

在此感謝我的院各級(jí)領(lǐng)導(dǎo)，特別是我的指導(dǎo)老師趙宇軍教授。

201*年7月

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山西農(nóng)業(yè)大學(xué)

教學(xué)實(shí)習(xí)總結(jié)

專業(yè)動(dòng)物檢疫年級(jí)班級(jí)

姓名學(xué)號(hào)

指導(dǎo)教師趙宇軍職稱副教授

動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)實(shí)習(xí)總結(jié)

實(shí)習(xí)時(shí)間：201*年5月8日至8月13日

實(shí)習(xí)地點(diǎn)：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室指導(dǎo)老師：趙宇軍

實(shí)習(xí)內(nèi)容：時(shí)間過(guò)的很快，轉(zhuǎn)眼間三年的大學(xué)生活就結(jié)束了，我們動(dòng)物檢疫專業(yè)的同學(xué)從五月份開始了為期3個(gè)多月的教學(xué)實(shí)習(xí)，在眾多輔導(dǎo)老師之中，我有幸跟隨我校動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防系的趙宇軍教授進(jìn)行學(xué)習(xí)。實(shí)習(xí)地點(diǎn)為我校獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)習(xí)內(nèi)容自行選擇。在老師的帶領(lǐng)下我進(jìn)行了大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和食物中金黃葡萄球菌的檢驗(yàn)。下面我們來(lái)回顧這次實(shí)驗(yàn)。

大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

一、培養(yǎng)基配置

我們一般用LB液體培養(yǎng)基來(lái)擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌，培養(yǎng)后可在LB固體培養(yǎng)基上劃線分離。以下為本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基配置步驟：

1．稱量：準(zhǔn)確稱取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，加水50ml。配置LB固體培養(yǎng)基時(shí)還需加1g瓊脂。

2．溶化：加熱熔化，用蒸餾水定容到50mL。配置LB固體培養(yǎng)基時(shí)還需加瓊脂，整個(gè)過(guò)程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。3．調(diào)pH：用1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至偏堿性。

4．滅菌：在兩個(gè)250ml的三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基，加上棉塞。將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好，放入滅菌鍋內(nèi)，1kg壓力滅菌15min。5．倒平板：滅菌后，待固體培養(yǎng)基冷卻至60℃左右時(shí)在酒精燈火焰附近操作進(jìn)行。其過(guò)程是：①將滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁，右手拿裝有培養(yǎng)基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通過(guò)火焰；③用左手將培養(yǎng)皿打開一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋；④待平板冷卻凝固后，將平板倒過(guò)來(lái)放置。二、滅菌和消毒1．無(wú)菌技術(shù)：①對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；②將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌；③為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰旁進(jìn)行；④避免已滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。2．消毒方法：①日常生活經(jīng)常用到的是煮沸消毒法；②對(duì)一些不耐高溫的液體，則使用巴氏消毒法；③對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用紫外線進(jìn)行物理消毒；④實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用酒精進(jìn)行消毒。3．滅菌方法：①接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；②培養(yǎng)基、無(wú)菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋；③表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。三、細(xì)菌的分離

采用劃線分離法，其操作步驟是：將培養(yǎng)皿底部用拇指和無(wú)名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開。在此同時(shí)，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線3～5條，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角，用燒過(guò)冷卻的接種針，通過(guò)第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，通過(guò)第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過(guò)第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線時(shí)，接種針應(yīng)與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養(yǎng)。

四、菌落和菌種種類的辨認(rèn)細(xì)菌的菌落表面一般是光滑而濕潤(rùn)的，有黏稠性，多數(shù)透明或半透明，但也有細(xì)菌的菌落表面是干燥、有褶皺的；放線菌由于有纖細(xì)的菌絲并可產(chǎn)生孢子，所以菌落表面是緊密的絨狀、堅(jiān)實(shí)多皺，長(zhǎng)孢子后就成粉末狀，由于菌絲和孢子有多種色素，所以在菌落培養(yǎng)基底部和菌落表面都有不同的顏色，菌落不易用接種環(huán)挑動(dòng)；酵母菌落類似于細(xì)菌菌落，表面光滑而濕潤(rùn)，有黏稠性但大多呈乳白色，少數(shù)呈紅色。

食品中金黃葡萄球菌的檢測(cè)方法

金黃色葡萄球菌是一種引起人類和動(dòng)物化膿感染的重要致病菌，也是造成人類食物中毒的常見致病菌之一。本菌廣泛分布于自然界，如空氣、土壤、水及其它環(huán)境中。在人類和動(dòng)物的皮膚及外界相通的腔道中，也經(jīng)常有本菌存在。據(jù)報(bào)導(dǎo)，在正常人群中的帶菌率可達(dá)30%~80%，其中皮膚帶菌率為8~22%，鼻腔和咽喉部等上呼吸道的帶菌率在40~50%以上，因此其可通過(guò)各種途徑和方式，尤其是經(jīng)工作人員的手和上呼吸道而污染食品。由于致病金黃葡萄球菌能產(chǎn)生腸毒素，故一旦細(xì)菌污染食品，并在合適的溫度環(huán)境下，細(xì)菌可以大量繁殖并產(chǎn)生腸毒素，從而引起消費(fèi)者食物中毒。

我國(guó)對(duì)金黃色葡萄球菌目前采用的方法是以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB.4789-10-84及檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN.0172-92作為依據(jù)。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程獲得最終結(jié)果須時(shí)5天左右，既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，并造成貨物積壓，也影響貨物的及時(shí)出運(yùn)，并使貨主的倉(cāng)儲(chǔ)成本提高，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。

多年來(lái)很多食品微生物實(shí)驗(yàn)室都在探索和尋找一些準(zhǔn)確性高，并快速的檢測(cè)方法，最近我們分別從美國(guó)3M公司和法國(guó)生物梅里埃公司獲得兩種快速檢測(cè)致病性金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基，其名稱為：①PetrifilmRSA.CountPlate（由美國(guó)3M公司研制生產(chǎn)），是一種薄膜型快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)平板。②Baird-parker+RPFAgar.（由法國(guó)生物梅里埃公司研制生產(chǎn)的用Baird-Parker瓊脂加免血漿纖維蛋白原的金黃色葡萄球菌檢測(cè)計(jì)數(shù)平板）。一、實(shí)驗(yàn)原理

Petrifilm.RSA.測(cè)試薄膜是由二部分組成。第一部分是由黃金色葡萄球菌培養(yǎng)基片，此培養(yǎng)基中含有經(jīng)修正的Barid-Parker，營(yíng)養(yǎng)成分加上以冷水可溶解的膠質(zhì)。第二部分是一種耐熱核酸酶（TNase）反應(yīng)片，含有DNA及甲苯胺蘭(ToluidineBlue-O)及四唑指示劑(Tetraeolium)。此指示劑有助于菌落的計(jì)數(shù)及確定葡萄球菌耐熱核酸酶的存在。

耐熱去氧核糖核酸（deoxyribonulcasDnase）為產(chǎn)毒金葡菌之典型特征，此酶非常耐熱，在100℃加熱30min，不易喪失活性，在130℃之下，其D值為16.6min，此酶之分子量為16800，等電點(diǎn)PH為9.6,耐熱去氧核糖酸與檢測(cè)血漿凝固酶相似，是一種鑒定金黃色葡萄球菌的方法，在Petrifilm.RSA檢測(cè)片上，耐熱DNA酶反應(yīng)看起來(lái)，呈粉紅色環(huán)帶包圍著一個(gè)紅色或蘭色的菌落。

Petrifilm.RSA檢測(cè)片，必須與Peyrifilm耐熱核酸酶反應(yīng)片一起使用，單獨(dú)使用將不會(huì)顯示菌落，因?yàn)榫哂休o助計(jì)數(shù)菌落的指示劑是在反應(yīng)片上，而不是在Petrifilm.RSA檢測(cè)片上。

Baird-parker+RPFagar，這一培養(yǎng)基中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，其中以氯化鋰代替亞碲酸鉀，使菌落顏色呈黑色，RPF補(bǔ)充有兔血漿和牛纖維蛋白原，以便檢測(cè)凝固酶活力，胰酶可以抑制全部或部分圍繞凝固酶陽(yáng)性菌落周圍沉淀暈環(huán)纖維蛋白的溶解，因此凡存在血漿凝固酶陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌，將在培養(yǎng)基中呈現(xiàn)有暈環(huán)的黑色菌落，即可確認(rèn)，并作計(jì)數(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)步驟材料和方法：

本次實(shí)驗(yàn)采用以下3種試劑：

1.美國(guó)3M公司提供的Petrifilm.Rapid.S.aureusCountPlate.2.法國(guó)生物~梅里埃公司提供的Baird-Parker+RPFagar.

3.實(shí)驗(yàn)室自配Baird-Park瓊脂（英國(guó)Oxoid）及新鮮兔血漿。

菌種來(lái)自美國(guó)菌種保存中心（AmericaTyPCultureCollection）。金黃色葡萄球菌共10株菌株，其菌號(hào)分別為：

ATCC27661ATCC27664ATCC13565ATCC51704

ATCC(K)12600ATCC(R)65389ATCC25923ATCC29213ATCC8095ATCC12598

非金黃色葡萄球菌菌種5株，其菌號(hào)分別為：ATCC51813（大腸桿菌）、ATCC624（無(wú)乳鏈球菌）、ATCC51816（陰溝腸桿菌）、ATCC6051（枯草桿菌）、ATCC49214（腸炎沙門氏菌）、自然食品檢樣，任意購(gòu)自市場(chǎng)。本次實(shí)驗(yàn)是以同一測(cè)試樣品經(jīng)均質(zhì)并通過(guò)無(wú)菌生理鹽水作10倍遞增稀釋后取1至2個(gè)稀釋度同時(shí)接種上述三種培養(yǎng)基作平行實(shí)驗(yàn)，在取得最終結(jié)果后相互進(jìn)行比對(duì)。

上述三種培養(yǎng)基的接種方法是按生產(chǎn)商所提供的使用說(shuō)明進(jìn)行操作，另外Baird-ParkerAgar培養(yǎng)基是按SN0172-92標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。

A、本次實(shí)驗(yàn)共測(cè)試已知標(biāo)準(zhǔn)菌種共15株，其中葡萄球菌10株，其他菌種5株（包括大腸桿菌、陰溝腸桿菌、腸炎沙門氏菌、枯草桿菌和無(wú)乳鏈球菌）。

B、測(cè)試自然食品檢樣共101只（其中包括肉11只、肉類14只、水產(chǎn)品17只、牛奶25只、蔬菜22只、豆制品12只）。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

A、被檢菌種10株，金黃色葡萄球菌在三種培養(yǎng)基上都能檢出生長(zhǎng)情況良好，同一稀釋度的菌液，除個(gè)別菌株外在3種培養(yǎng)基計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果基本都在一個(gè)數(shù)量級(jí)上，無(wú)顯著差異。而5株非金黃色葡萄球菌的菌株在三種培養(yǎng)基上全部不能生長(zhǎng)。

B、自然食品檢樣共接種101只，每一檢樣同一稀釋濃度分別同時(shí)種三種培養(yǎng)基，最終共檢出金黃色葡萄球菌45只，占全部檢樣的44.5％，其中PetrifilmRSA檢出陽(yáng)性結(jié)果為42只，占全部陽(yáng)性檢樣的93.3％，Baird-Parker＋RPFAgar.檢出陽(yáng)性結(jié)果26只，占全部陽(yáng)性檢樣的57.7％。Baird-Parker.Agar檢出陽(yáng)性結(jié)果32只，占全部陽(yáng)性檢樣的71.1％。四、實(shí)驗(yàn)討論

1.用15株標(biāo)準(zhǔn)菌在3種培養(yǎng)基中的檢測(cè)，10株金黃色葡萄球菌以同一濃度接種，結(jié)果生長(zhǎng)良好，其最終計(jì)數(shù)基本一致，定位在同一數(shù)量級(jí)，5株非金黃色葡萄球菌接種上述三種培養(yǎng)基全部不長(zhǎng)，說(shuō)明上述三種培養(yǎng)基對(duì)金黃色葡萄球菌選擇良好。

2.以101只自然樣品同一均質(zhì)稀釋液，同時(shí)接種三種培養(yǎng)基，從最終結(jié)果來(lái)看，對(duì)金黃色葡萄球菌的陽(yáng)性檢出率為44.5％

3.從檢測(cè)程序來(lái)年，Petrifilm.RSA及Baird-Parker＋RPF.Agar.都在樣品接種后28~30h觀察結(jié)果，并不必再做證實(shí)試驗(yàn)，而如以Baird-ParkerAgar檢測(cè)，須在接種后48h觀察平板，并挑取可疑菌落轉(zhuǎn)種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中，在經(jīng)18-24h后做血漿凝固酶或耐熱DNA酶試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)，最終計(jì)數(shù)，前后約須80h。4.從本次試驗(yàn)中觀察，使用上述三種培養(yǎng)基對(duì)食品中金黃色葡萄球菌含量的直接計(jì)數(shù)檢測(cè)，其樣品接種液的含量擬控制在100個(gè)/ml以內(nèi)，比較容易分清并計(jì)數(shù)，如菌量過(guò)濃，則將會(huì)影響最后的讀數(shù)，因此對(duì)新送的被檢樣品，如在不了解污染的情況下一般必須要做2個(gè)以上的稀釋度，同時(shí)分別接種，才能獲得較為滿意的結(jié)果。

而在Baird-Parker＋RPFAgar及Baird-Parker.Agar接種時(shí)必須將1ml樣液作三只平板涂布（0.3、0.3、0.4ml）這樣就會(huì)造成手續(xù)繁瑣試劑消耗較大，但Baird-Parker.RPF.培養(yǎng)基也可以1ml樣液作傾注培養(yǎng)，并作計(jì)數(shù)。5.在整個(gè)測(cè)試過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)，按使用說(shuō)明對(duì)Petrifilm.RSA.及Barid-Parker＋RPF.Agar，操作規(guī)定在接種24h后觀察結(jié)果，此時(shí)往往由于菌落長(zhǎng)得經(jīng)較小，特征瓜不明顯，但如果繼續(xù)放置一夜以后金葡萄菌落特征明顯，并可能會(huì)經(jīng)第一天觀察數(shù)量有所增加，這樣可以提高檢測(cè)結(jié)果的可信度。

6.由于對(duì)上述兩種培養(yǎng)基的試用期間我們尚未獲得供應(yīng)商的報(bào)價(jià)，故無(wú)法測(cè)算每一樣品的測(cè)試成本價(jià)格。但可以予計(jì)上述兩面種快速檢測(cè)培養(yǎng)基的耗材費(fèi)用要高于常規(guī)經(jīng)典方法（Baird-ParkerAgar）的費(fèi)用。7.通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，我們感到使用美國(guó)3M公司生產(chǎn)的Petrifilm.RSAPlate培養(yǎng)基和法國(guó)生物－梅利埃公司生產(chǎn)的Baird-ParkerRPF.Agar培養(yǎng)基檢測(cè)中的金黃色葡萄球菌�？梢员饶壳俺Ｒ�(guī)檢測(cè)方法時(shí)間可縮短一半。并可以明顯節(jié)省大量人力。這完全符合實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)的要求，尤其是對(duì)基層較簡(jiǎn)陋的實(shí)驗(yàn)室條件中，更顯其使用方便的優(yōu)越性。

實(shí)習(xí)總結(jié)：通過(guò)這次嚴(yán)謹(jǐn)而有序的實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)，為我們先前在教學(xué)中學(xué)習(xí)到的知識(shí)提供了一個(gè)實(shí)際的操作實(shí)施平臺(tái)，也為今后在這方面檢驗(yàn)技術(shù)的工作起到了指引作用。在過(guò)去的學(xué)習(xí)中，我們并不了解具體的病原微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)技術(shù)的具體流程，注意事項(xiàng)等等非常關(guān)鍵和必須的防御手段。通過(guò)此次生產(chǎn)實(shí)習(xí)，使我們對(duì)以前所不熟知的問(wèn)題有了深入的認(rèn)識(shí)，也對(duì)目前的情況有所思考和感悟。在我看來(lái)，動(dòng)物檢疫人員在我國(guó)國(guó)民生活中起到了關(guān)鍵作用，民以食為天，沒有認(rèn)真負(fù)責(zé)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，將給社會(huì)帶來(lái)巨大的飲食災(zāi)難，為此，我感到非常自豪和驕傲。在今后的工作學(xué)習(xí)中，我將一如既往的認(rèn)真下去，無(wú)愧自己的職責(zé)和稱號(hào)。

在此感謝我院的各級(jí)領(lǐng)導(dǎo)，特別是我的指導(dǎo)老師趙宇軍教授。

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