微生物檢驗(yàn)員

微生物檢驗(yàn)員

發(fā)布時(shí)間：201*-02-20性別要求：不限有效期限：五個(gè)月薪酬待遇：面議工作地點(diǎn)：全國學(xué)歷要求：本科以上工作經(jīng)驗(yàn)：2年以上招聘人數(shù)：1人

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職位類別：生產(chǎn)/科研/質(zhì)管類質(zhì)檢/QC崗位職責(zé)：

1、工藝用水的微生物、內(nèi)毒素；

2、產(chǎn)品的無菌、微生物限度、內(nèi)毒素或抗原檢查；3、包裝材料的無菌、內(nèi)毒素的檢查等；4、無菌、微生物限度檢查法方法的建立。

任職條件：

1、年齡40周歲以下，本科及以上學(xué)歷，生物工程、藥學(xué)等相關(guān)專業(yè)；2、具備一年以上的藥品微生物檢驗(yàn)工作經(jīng)驗(yàn)；

3、熟悉藥品微生物檢驗(yàn)方法，具有微生物、內(nèi)毒素；

4、熟悉質(zhì)量體系專業(yè)知識(shí)，具有使用和維護(hù)檢驗(yàn)儀器的能力。面試須知1.請(qǐng)您詳細(xì)注冊(cè)簡歷，特別是工作經(jīng)歷、教育培訓(xùn)部分2.請(qǐng)通過獵才醫(yī)藥網(wǎng)()點(diǎn)擊“投遞簡歷”。3.如果簡歷通過內(nèi)容審閱，我們將盡快與您取得聯(lián)系，謝謝。

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一.基礎(chǔ)知識(shí)

（一）微生物基礎(chǔ)知識(shí)

1.培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實(shí)驗(yàn)和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，使用的原料也各有差異，但從營養(yǎng)角度分析，培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長素以及水分等。另外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。

瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應(yīng)用最廣的凝固劑。加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反復(fù)融化，其凝固性降低。

任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應(yīng)及時(shí)徹底滅菌，以備純培養(yǎng)用。一般培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。（二）消毒與滅菌知識(shí)5.2滅菌方法

滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類。本實(shí)驗(yàn)主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。

加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。通過加熱使菌體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到殺菌目的。蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關(guān)，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因?yàn)樵跐駸崆闆r下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固；同時(shí)濕熱的穿透力強(qiáng)，可增加滅菌效力。

（三）潔凈室行為規(guī)范（四）實(shí)驗(yàn)室安全知識(shí)

二.基本操作

（一）培養(yǎng)基配制、滅菌、使用和保藏

1.配制

1.1按照培養(yǎng)基瓶簽所示，準(zhǔn)確稱量一定培養(yǎng)基干粉于合適的容器，加純化水溶解。

1.2根據(jù)培養(yǎng)基對(duì)pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調(diào)至所需pH。1.3如需分裝，應(yīng)先加熱攪拌，待培養(yǎng)基完全溶解并均一后進(jìn)行。分裝時(shí)注

意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過三角瓶容積的一半為宜。

1.4培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面，

斜面長度一般以不超過試管長度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。2.滅菌

2.1按照培養(yǎng)基瓶簽所示的滅菌條件（溫度和時(shí)間）對(duì)配制好的培養(yǎng)基進(jìn)行

高壓滅菌。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行滅菌。3.保藏和使用3.1液體培養(yǎng)基管

置專用不銹鋼筒內(nèi)，2～25℃避光保存，3周內(nèi)使用。在不銹鋼筒貼標(biāo)簽，標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、培養(yǎng)基配制日期、高壓滅菌編號(hào)等信息。不同批次培養(yǎng)基不得置于同一不銹鋼筒內(nèi)。3.2平板和接觸皿

置專用不銹鋼筒，標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、制備日期、培養(yǎng)基的滅菌編號(hào)，用保鮮膜密封筒口后，2～25℃避光保存，3周內(nèi)使用。不同批次平板和接觸皿不得置于同一容器內(nèi)。

3.3培養(yǎng)基使用之前應(yīng)預(yù)培養(yǎng)，合格后方可使用。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：25-35℃，預(yù)培養(yǎng)3天。硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基：25-35℃，預(yù)培養(yǎng)2天。

虎紅瓊脂培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基：23-28℃，預(yù)培養(yǎng)3天。

（二）消毒劑配制和使用

1.0.1%新潔爾滅溶液的配制和使用

1.1基準(zhǔn)處方：5%新潔爾滅溶液20ml＋注射用水980ml1.2作為手部和衣服浸泡消毒，設(shè)備、操作臺(tái)面和潔凈室六面擦洗消毒以及

地漏消毒用，有效期為3個(gè)月。2.75%酒精的配制與使用

2.1基準(zhǔn)處方：95%乙醇790ml＋純化水210ml

2.2作為消毒雙手（手套），擦洗設(shè)備、操作臺(tái)等表面消毒劑，有效期為14天。

3.2%來蘇兒（甲酚皂）溶液的配制和使用

3.1基準(zhǔn)處方：50%來蘇兒（甲酚皂）溶液40ml＋純化水960ml3.2拖擦地面用，臨用前配制。4.甲醛熏蒸

作為環(huán)境空氣和表面消毒劑。

操作步驟：關(guān)閉風(fēng)機(jī)→無關(guān)人員撤出消毒區(qū)，操作人員戴防護(hù)手套和防毒面具→將設(shè)備及器具暴露于空氣中→將盛有甲醛溶液的不銹鋼飯盒置不銹鋼臺(tái)面→上層飯盒倒入需要體積的甲醛（10ml/m3，每只飯盒不得多于250ml），下層飯盒倒入300ml95%或無水乙醇→點(diǎn)燃下層飯盒內(nèi)乙醇，操作人員迅速離開→保留被消毒空間的甲醛氣體至少8小時(shí)→消毒結(jié)束后，開啟風(fēng)機(jī)，直至消毒空間無甲醛刺激性氣味，方可進(jìn)入工作。

5.臭氧消毒

5.1作為環(huán)境空氣和表面消毒劑。

5.2操作步驟：關(guān)閉風(fēng)機(jī)→無關(guān)人員撤出消毒區(qū)，操作人員戴防護(hù)手套和防

毒面具→將設(shè)備及器具暴露于空氣中→設(shè)定消毒時(shí)間，開啟臭氧法生器面→操作人員迅速離開→保留被消毒空間的臭氧氣體至少8小時(shí)→消毒結(jié)束后，開啟風(fēng)機(jī)，直至消毒空間無臭氧氣味，方可進(jìn)入工作。6.消毒劑交替使用

6.1隔周交替使用0.1%新潔爾滅溶液和75%酒精進(jìn)行手部消毒。6.2隔周交替使用0.1%新潔爾滅溶液和2%來蘇爾溶液拖擦地面。6.3潔凈區(qū)每月對(duì)空氣消毒一次，甲醛消毒6個(gè)月一次，其余時(shí)間采用臭氧消毒。

（三）微生物室設(shè)備與設(shè)施

1.高壓滅菌器

1.1原理：高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，

通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽,待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100℃的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。1.2操作步驟：向高壓滅菌器滅菌艙內(nèi)加水至排泄管口高度→放入待滅菌物

品，關(guān)閉滅菌器蓋→開啟電源，設(shè)置滅菌溫度和時(shí)間以及排氣溫度→按start鍵開始滅菌（依次經(jīng)歷：升溫排氣升壓保壓降壓排氣降溫）→滅菌結(jié)束后，取出滅菌物品，關(guān)閉電源→清潔滅菌艙。1.3注意事項(xiàng)

待滅菌物品間應(yīng)留適宜間隙，便于蒸汽穿透。

當(dāng)溫度在80℃以上時(shí)，蓋將不會(huì)被打開；當(dāng)溫度低于60℃時(shí)，即可開蓋。每次滅菌前應(yīng)保持滅菌艙內(nèi)水位在規(guī)定線以上。

干熱滅菌法常用于空玻璃器皿、金屬器具的滅菌。凡帶有膠皮的物品，液體及固體培養(yǎng)基等都不能用此法滅菌。5.2.2.2干燥箱滅菌

將包扎好的物品放入干燥烘箱內(nèi)，注意不要擺放太密，以免妨礙空氣流通；不得使器皿與烘箱的內(nèi)層底板直接接觸。將烘箱的溫度升至160～170℃并恒溫1～2h，注意勿使溫度過高，超過170℃，器皿外包裹的紙張、棉花會(huì)被烤焦燃燒。如果是為了烤干玻璃器皿，溫度為120℃持續(xù)30分鐘即可。溫度降至60～70℃時(shí)方可打開箱門，取出物品，否則玻璃器皿會(huì)因驟冷而爆裂。

用此法滅菌時(shí)，絕不能用油、蠟紙包扎物品。5.2.2.3火焰滅菌

直接用火焰灼燒滅菌，迅速徹底。對(duì)于接種環(huán)，接種針或其它金屬用具，可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進(jìn)行滅菌。此外，在接種過程中，試管或三角瓶口，也采用通過火焰而達(dá)到滅菌的目的。2.烘箱（干熱滅菌）

2.1原理：通過使用干熱空氣殺滅微生物。一般是把待滅菌的物品放入電烘

箱中烘烤，加熱至160～170℃維持2h（除熱原要求250℃維持1h）。2.2操作步驟：將待滅菌物品正確包扎與加塞，以免滅菌后被外界污染→將

包扎好的物品放入干燥烘箱內(nèi)→3.超凈工作臺(tái)4.培養(yǎng)箱5.集菌儀6.傳遞窗7.潔凈室

（四）平板和接觸皿制備

將需倒平板的培養(yǎng)基，于水浴鍋中冷卻到45～50℃,立刻倒平板。（五）微生物數(shù)量測定

三.檢驗(yàn)項(xiàng)目

（一）微生物限度檢查（二）無菌檢查（三）環(huán)境監(jiān)控檢查（四）模擬灌裝檢查（五）培養(yǎng)基靈敏度檢查（六）菌株傳代與保藏

四.其它

（一）微生物形態(tài)觀察（菌落形態(tài)、染色與鏡檢）（二）微生物分離純化培養(yǎng)（三）API法鑒定微生物（四）PCR法鑒定微生物

7思考

7.1制備培養(yǎng)基的一般程序是什么？

7.2做過本次實(shí)驗(yàn)后，你認(rèn)為在制備培養(yǎng)基時(shí)要注意些什么問題？7.3滅菌在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作中有何重要意義？4試述高壓蒸汽滅菌的操作方法和原理。5高壓蒸汽滅菌時(shí)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？

微生物檢驗(yàn)人員培訓(xùn)資料

湖南恒生制藥有限公司

藥品微生物檢驗(yàn)用菌種的傳代和保藏

浙江省藥品檢驗(yàn)所

葉銘龍

菌種的定義及其與各應(yīng)用領(lǐng)域的關(guān)系

菌種泛指從自然界獲取的各種微生物的不同的種。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究菌種主要考慮其致病機(jī)理工業(yè)生產(chǎn)研究菌種主要考慮其發(fā)酵機(jī)理藥品微生物檢驗(yàn)主要考慮其標(biāo)準(zhǔn)性

標(biāo)準(zhǔn)菌種的概念及其管理

標(biāo)準(zhǔn)菌種是指由國家授權(quán)機(jī)構(gòu)制備的具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性并用妥善方法保藏

的菌種。

我國的標(biāo)準(zhǔn)菌種統(tǒng)一由中國菌種保藏管理委員會(huì)（CCCCM）管理，涉及藥品微

生物檢驗(yàn)的菌種由醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCC）提供

標(biāo)準(zhǔn)菌種的保藏形式

我國提供的標(biāo)準(zhǔn)菌種通常是以凍干粉的形式包裝于熔封的厚玻璃容器中。在這種容器中，微生物通常與賦形劑共存，由于缺乏生長必須的環(huán)境條件，一般呈休眠狀態(tài)。純培養(yǎng)

所謂微生物的純培養(yǎng)是指在一個(gè)微生物的菌落形成單位中，所有的微生物細(xì)胞或孢子都屬于生物學(xué)的同一個(gè)種。嚴(yán)格地說，純培養(yǎng)是在培養(yǎng)基上由一個(gè)細(xì)胞或孢子分裂、繁殖而產(chǎn)生的后代。在該細(xì)胞或孢子的生長過程種，不受其他微生物的侵犯，不會(huì)在培養(yǎng)物中產(chǎn)生另外微生物種的后代，在整個(gè)生長過程中不發(fā)生變異或死亡。獲取純培養(yǎng)的工作環(huán)境1、潔凈工作室：環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)，全過程必須無菌操作，防止微生物污染。2、無菌隔離艙獲取純培養(yǎng)的接種工具1、接種環(huán)2、接種針3、接種鏟4、接種鉤5、其他玻璃器械獲取純培養(yǎng)的其他器具

1、玻璃器皿：如各種規(guī)格培養(yǎng)皿。

2、微生物實(shí)驗(yàn)室常用的設(shè)備，如高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱等獲取純培養(yǎng)的主要技術(shù)－移植（又稱接種）

微生物的移植（或稱接種）是指將微生物接種在培養(yǎng)基上的操作。移植（又稱接種）的兩種方式－劃線和穿刺

1、劃線法是指用接種工具將微生物細(xì)胞移植在固體培養(yǎng)基斜面或平板上的一種方法。

2、穿刺法是指用接種工具將微生物細(xì)胞移植到固體或半固體培養(yǎng)基內(nèi)的一種方法。

影響集菌培養(yǎng)效果的若干因素

溫度滲透壓氧氣光pH

值和氧化還原電位

培養(yǎng)基抗生素

驗(yàn)證純培養(yǎng)的主要依據(jù)

1、用顯微鏡觀察時(shí)，全部的生物個(gè)體是相似的，如果是細(xì)菌，對(duì)革蘭氏染色反應(yīng)應(yīng)當(dāng)是一致的。

2、將培養(yǎng)物制成懸液，重新傾注平板，或平板劃線培養(yǎng)后，所形成的全部菌落的形態(tài)應(yīng)該是相似的。如果是細(xì)菌，將重新形成的菌落各作穿刺培養(yǎng)，其培養(yǎng)特征應(yīng)當(dāng)是一致的。

3、從重新分離的各菌落作生理特征觀測時(shí)，如對(duì)氮源的利用，對(duì)糖類的發(fā)酵或同化以及其他生理生化的測定，應(yīng)呈現(xiàn)出一致性。定期移植保藏法

一般步驟為：將菌種接種在所要求的培養(yǎng)基上，置最適溫度下集菌培養(yǎng)。得到健壯的菌體（如有性孢子、無性孢子或細(xì)胞等）后，放于溫度較低、干燥處保藏，并且每隔一定時(shí)間重新移植培養(yǎng)一次。定期移植保藏法

1、細(xì)菌置4～6℃保藏，芽孢桿菌每3～6個(gè)月移植一次，其他細(xì)菌每月移植一次。

2、放線菌于4～6℃保藏，每3個(gè)月移植一次。3、酵母菌于4～6℃保藏，每4～6個(gè)月移植一次。4、絲狀真菌于4～6℃保藏，每3個(gè)月移植一次。5、擔(dān)子菌于4～6℃保藏，每3個(gè)月移植一次。6、保藏的濕度通常在50％～70％為宜。定期移植保藏法1、需定期檢查

2、移植進(jìn)行時(shí)，應(yīng)仔細(xì)核對(duì)

3、集菌培養(yǎng)完成后，應(yīng)比較培養(yǎng)特征4、應(yīng)注意觀察各代之間的變化瓊脂斜面低溫保藏法

1、菌種的典型菌落接種至斜面，規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，充分生長，硅膠塞換成無菌橡膠塞。4～6℃冰箱保藏

a:1～3個(gè)月移植一次，繼續(xù)保藏。

b:用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，可保藏半年至一年。瓊脂斜面低溫保藏法

適用細(xì)菌、霉菌、酵母菌及放線菌保藏優(yōu)點(diǎn)：簡便、大多數(shù)微生物適用

缺點(diǎn)：保藏期短；傳代次數(shù)多；容易發(fā)生變異及污染。

生孢梭菌用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、乙型溶血性鏈球菌及肺炎球菌用血肉湯（瓊脂）

培養(yǎng)基

液體石蠟保藏法

一般步驟為：準(zhǔn)備液體石蠟并滅菌去水備用。獲得需要保藏菌種的純培養(yǎng)，將液體石蠟注入培養(yǎng)容器中，并完全覆蓋培養(yǎng)基。液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基上端0.5～1cm為宜4～6℃冰箱保藏

液體石蠟保藏法甘油冷凍保藏法

將保藏菌種接種瓊脂斜面上，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時(shí)間，用無菌接種環(huán)輕輕刮

取菌苔，并通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦使菌種充分?jǐn)U散到無菌水中，調(diào)證菌液濃度，向已制備好的菌懸液加入等體積的20％無菌甘油，輕輕振試管管，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無菌小管。甘油冷凍管最好在-30℃貯存。沙管保藏法

制備沙管培養(yǎng)接種制備菌懸液混菌干燥保藏

適合保藏芽孢桿菌、梭菌、放線菌和一些絲狀真菌。

土壤保藏法

用土壤替代沙管保藏法中的河沙，其余操作與沙管保藏法相同適合保藏土壤細(xì)菌、放線菌和絲狀真菌，時(shí)間為

2～6年。硅膠保藏法

用硅膠替代沙管保藏法中的河沙，其余操作與沙管保藏法相同適合保藏酵母菌和某些絲狀真菌

濾紙保藏法

保藏微生物細(xì)胞或孢子的載體為濾紙。

對(duì)細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌等都有一定的效果，有些菌種最長可達(dá)

17年。

明膠片保藏法

制備無菌營養(yǎng)明膠制備無菌石蠟濾紙

微生物培養(yǎng)并制成濃厚的懸液在懸液中加入營養(yǎng)明膠

將含微生物細(xì)胞或孢子的營養(yǎng)明膠滴于石蠟濾紙表面干燥

將形成的明膠片密封保藏

麩皮保藏法

我國歷史悠久的微生物保藏法

適于保藏根霉、曲霉、青霉、紅曲霉等屬和赤霉菌

梭氏真空干燥保藏法

在小試管中放置菌懸液小試管在大試管中放置大試管在真空狀態(tài)下干燥密封大試管

液體直接干燥保藏法

需要加入保護(hù)劑干燥之前不需凍結(jié)

在干燥過程中為增大蒸發(fā)面積，可加入多孔材料干燥后的容器應(yīng)熔封

蒸餾水保藏法

最為簡便的微生物保藏法微生物細(xì)胞或孢子保藏在蒸餾水中保藏的容器應(yīng)密封

適于保藏棒狀桿菌、土壤桿菌和假單孢菌等

液氮冰箱超低溫保藏法

需專用設(shè)備－液氮超低溫冰箱菌懸液密封于安瓿管內(nèi)，控速凍結(jié)國外已普遍采用保藏時(shí)間長

凍結(jié)真空干燥保藏法

歷史悠久，又稱凍干法

不產(chǎn)生孢子只產(chǎn)生菌絲體的絲狀真菌不宜采用該法適用面廣保藏時(shí)間可達(dá)

10年以上

多為菌種保藏機(jī)構(gòu)采用

凍結(jié)真空干燥保藏法

密封性好，可避免保藏期間的污染保藏容器體積小，方便攜帶和貯藏保藏時(shí)間更長，變異概率更低

普通微生物實(shí)驗(yàn)室適用的保藏技術(shù)

瓊脂斜面低溫保藏法液體石蠟保藏法低溫冷凍保藏法甘油冷凍保藏法

瓊脂斜面低溫保藏法

細(xì)菌置

4～6℃保藏，芽孢桿菌每3～6個(gè)月移植一次，其他細(xì)菌每月移植一次。4～6℃保藏，每3個(gè)月移植一次。

放線菌于酵母菌于4～6℃保藏，每4～6個(gè)月移植一次。4～6℃保藏，每4個(gè)月移植一次。

絲狀真菌于擔(dān)子菌于

4～6℃保藏，每3個(gè)月移植一次。

50％～70％為宜。

保藏的濕度通常在

菌種保藏的一般規(guī)定

1、菌種“代”的確定：201*版藥典規(guī)定，以干燥菌種管為第“0”代，由此得到的第一批子代為第一代，以此類推。

2、菌種傳代次數(shù)規(guī)定：201*版藥典規(guī)定不超過5代。

3、菌種應(yīng)專人保藏、專柜貯藏，認(rèn)真做好登記，統(tǒng)一編號(hào)，按期傳代，并做好有關(guān)檢驗(yàn)記錄。

4、保存菌種傳代或凍干均應(yīng)填寫專用記錄，菌種管上應(yīng)有標(biāo)簽，表明菌種編號(hào)、代次、批號(hào)、日期。

5、過期菌種應(yīng)及時(shí)處理、登記，經(jīng)121℃30分鐘滅菌消毒。實(shí)驗(yàn)室菌種傳代操作步驟

1、接種前用1：1000新潔爾滅擦拭工作臺(tái)面，然后開紫外燈消毒30分鐘。2、自冰箱取出保存工作用菌種，室溫放置20分鐘；溫度平衡后才能傳代。3、實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入緩沖間，換鞋、穿無菌衣、戴口罩，用1：1000新潔爾滅溶液

消毒雙手，并將培養(yǎng)基及菌種移入陽性菌接種室。

4、點(diǎn)燃酒精燈，將菌種管塞子，通過火焰轉(zhuǎn)動(dòng)使稍稍松動(dòng)，以免接種時(shí)粘著打

不開。

5、接種操作：左手拿住菌種管，將管口靠近火焰旁，右手拿接種棒，將白金耳

燒紅約30秒，桿部通過火焰滅菌。挑取少量菌苔；另取，照上述方法在火焰旁打開塞子，將白金耳伸入管內(nèi)斜面培養(yǎng)基的底部，從下到上將白金耳輕貼斜面培養(yǎng)基的表面作曲折移動(dòng)。

5、接種后，將斜面置規(guī)定溫度、時(shí)間培養(yǎng)。取出觀察，菌種生長良好，換橡皮

塞，貼上標(biāo)簽，放入冰箱保存。

6、細(xì)菌一個(gè)月傳代一次，枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠

菌、黑曲霉可三個(gè)月傳代一次。菌種管理

1、標(biāo)準(zhǔn)菌種必須從認(rèn)可的菌種收集途經(jīng)獲得；實(shí)驗(yàn)室必須建立和保存所有菌種

的收集、貯藏、保存、確認(rèn)試驗(yàn)的記錄。

2、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有文件管理標(biāo)準(zhǔn)菌種（從原始菌種到工作用菌種）。該程序應(yīng)包括：

a:標(biāo)準(zhǔn)菌種必須定期傳代，并做確認(rèn)試驗(yàn)，包括實(shí)驗(yàn)室在所需要關(guān)鍵診斷指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)室必須記錄并保存。

b：每一子菌種都應(yīng)以適當(dāng)標(biāo)簽、標(biāo)記來表示名稱、標(biāo)準(zhǔn)號(hào)、接種日期和傳代日期。

C:每一子菌種都應(yīng)以標(biāo)記從原始菌種傳代到工作用菌種的代數(shù)；記錄菌種生長的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件；菌種生存條件等。過期菌種處理

過期菌種應(yīng)及時(shí)清理、登記，并經(jīng)

121℃、30分鐘高壓消毒滅菌。

例1：金黃色葡萄球菌傳代保藏技術(shù)

1、購置金黃色葡萄球菌（如我所提供的菌種為第二代菌種），假定購置日期為

5月21日。

2、準(zhǔn)備10支營養(yǎng)瓊脂斜面，其中2支用于保藏，其余8支用于當(dāng)月實(shí)驗(yàn)。3、于5月22日打開菌種管，接種菌種至上述10支斜面，35℃培養(yǎng)16～18小

時(shí)。

4、將10支第三代菌種管做好標(biāo)簽，置適宜溫度保藏。5、5月22日至6月22日，可以使用上述第三代菌種管。6、至6月22日，重復(fù)步驟2，得第四代菌種管。7、至8月22日前，重新購置原種管。

例2：黑曲霉的傳代技術(shù)

1、制備孢子懸液：取滅菌水或生理鹽水

3～5ml，分2～3次小心滴加至菌種管

內(nèi)（試管斜面），反復(fù)振搖。傾取孢子懸液置另一滅菌試管。

2、涂布接種：用滅菌滴管吸取懸液滴加至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面，每管滴加

2～3滴，轉(zhuǎn)動(dòng)試管，使懸液與斜面表面充分接觸菌種確認(rèn)試驗(yàn)

包括以下幾個(gè)方面：1、菌落生長情況：目測2、染色鏡檢：

3、生化試驗(yàn)；(1)糖醇代謝試驗(yàn)

（2）氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)（3）碳源和氮源利用試驗(yàn)（4）酶類試驗(yàn)（5）其他試驗(yàn)短小芽孢桿菌

確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：

1、通過顯微鑒別，為不呈鏈狀排列的桿菌，革蘭氏染色為陽性。

2、營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔光滑，薄，閃光，蔓延，不粘著，常常是淺黃色。3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺、淀粉水解和硝酸鹽還原，結(jié)果為明膠緩慢液化，淀粉水解陰性，硝酸鹽還原陰性。

枯草芽孢桿菌

確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：

1、通過顯微鑒別，為呈鏈狀排列的桿菌，不形成莢膜，革蘭氏染色為陽性。2、營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔生長豐厚，粗糙，不透明，不閃光，蠟質(zhì)，蔓延，奶油色至微褐色。

3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺、淀粉水解和硝酸鹽還原，結(jié)果明膠呈漏斗形至層狀液化，淀粉水解陽性，硝酸鹽還原陽性。大腸埃希菌

確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：

1、通過顯微鑒別，為成對(duì)和呈短鏈排列的近球形的桿菌，一般不形成莢膜，革蘭氏染色為陰性。

2、營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔通常白色，有時(shí)帶黃白色，濕潤，閃光，蔓延生長。3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺和靛基質(zhì)試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V.P.試驗(yàn)和檸檬酸鹽利用試驗(yàn)，結(jié)果不液化明膠，靛基質(zhì)試驗(yàn)和甲基紅試驗(yàn)陽性，V.P.和檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性。大腸埃希菌

該菌為微生物限度檢查規(guī)定不得檢出的控制菌，有一整套完整的鑒定手段，也可參考該方法用于判斷所保藏的菌種有無發(fā)生變異。該鑒定方法主要內(nèi)容即為經(jīng)典的IMViC試驗(yàn)，結(jié)果為++--。

銅綠假單孢菌

確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：

1、通過顯微鑒別，為單個(gè)，成對(duì)或呈短鏈排列的桿菌，有運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏染色為陰性。

2、營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔生長旺盛，薄，白色，閃光，培養(yǎng)基變?yōu)榫G色至暗褐色或黑色，發(fā)熒光。

3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺、吲哚和硝酸鹽還原試驗(yàn)，結(jié)果迅速液化明膠，液體呈淺黃綠色或淺藍(lán)綠色，吲哚試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性。

銅綠假單孢菌

該菌為微生物限度檢查規(guī)定不得檢出的控制菌，可利用氧化酶試驗(yàn)和綠膿菌素試驗(yàn)迅速判斷所保藏的菌種有無發(fā)生變異。乙型副傷寒沙門菌

確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：

1、通過顯微鑒別，為單個(gè)出現(xiàn)的桿菌，有運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏染色為陰性。2、營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔淺灰色，濕潤，光滑，半透明。

3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺、吲哚、硫化氫和硝酸鹽還原試驗(yàn)，結(jié)果不液化明膠，吲哚試驗(yàn)陰性，硫化氫陽性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性。

乙型副傷寒沙門菌

該菌為微生物限度檢查規(guī)定不得檢出的控制菌，可利用三糖鐵瓊脂斜面和血清試驗(yàn)迅速判斷所保藏的菌種有無發(fā)生變異。藤黃微球菌

確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過顯微鑒別，為呈堆團(tuán)排列的球菌，革蘭氏染色為陽性。2、營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔硫黃色到酪黃色，光滑，軟。

3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺、硫化氫和硝酸鹽還原試驗(yàn)，結(jié)果緩慢液化明膠成漏斗形，硫化氫陽性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性。

金黃色葡萄球菌

確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：

1、通過顯微鑒別，為單個(gè)或成對(duì)呈短鏈和不規(guī)則堆團(tuán)狀排列的球菌，革蘭氏染色為陽性。

2、營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔生長茂盛，半透明，光滑，平坦，濕潤，白色至淺黃色或橙色。

3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺、硝酸鹽還原和過氧化氫酶試驗(yàn)，結(jié)果明膠呈囊狀液化，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性，過氧化氫酶試驗(yàn)陽性。金黃色葡萄球菌

該菌為微生物限度檢查規(guī)定不得檢出的控制菌，可利用血漿凝固酶試驗(yàn)迅速判斷所保藏的菌種有無發(fā)生變異。生孢梭菌

確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：

1、通過顯微鑒別，菌體粗大單獨(dú)存在或呈短鏈排列，芽孢比菌體寬，芽孢呈梭形，革蘭氏染色為陽性。2、過氧化氫酶試驗(yàn)陽性。白色念珠菌

確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：

1、通過顯微鑒別，可見卵形細(xì)胞，有多邊芽殖現(xiàn)象，有假菌絲。2、改良馬丁瓊脂斜面上菌苔生長茂盛，光滑，濕潤，菌落呈乳白色。黑曲霉

確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：

1、通過顯微鑒別，可見分隔菌絲體，分生孢子穗球形，黑色。

2、改良馬丁瓊脂斜面上菌苔呈黑褐色厚絨狀，色澤均一，無雜色，菌落呈黑色。

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