細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)總結(jié)
細(xì)胞自主實(shí)驗(yàn)方法總結(jié)及感想
自主實(shí)驗(yàn)是在老師的指導(dǎo)和幫助下學(xué)生自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)且自己準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需的一切準(zhǔn)備工作來(lái)完成的實(shí)驗(yàn)。平時(shí)做實(shí)驗(yàn)老師占重要地位但自主實(shí)驗(yàn)中學(xué)生占重要地位。自主實(shí)驗(yàn)中學(xué)生自己思考設(shè)計(jì)出實(shí)驗(yàn)方案,實(shí)驗(yàn)所需試劑,實(shí)驗(yàn)方法和步驟然后按該方案來(lái)做實(shí)驗(yàn)。
老師讓學(xué)生做自主實(shí)驗(yàn)的原因是老師想培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力,合作能力,想讓學(xué)生獨(dú)立思考,想讓學(xué)生親自動(dòng)手做實(shí)驗(yàn),最重要的一點(diǎn)是把理論知識(shí)結(jié)合實(shí)踐。
本次實(shí)驗(yàn)用了染色體組型分析實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)的核心是對(duì)染色體組進(jìn)行分析。人類染色體組型分析是將人的一個(gè)體細(xì)胞有絲分裂中期的染色體,在技術(shù)的基礎(chǔ)上,按照染色體的大小和形態(tài)特征(主要根據(jù)著絲點(diǎn)位置),對(duì)染色體進(jìn)行分組、排隊(duì)和配對(duì)。這對(duì)于探索人類遺傳病的發(fā)病機(jī)理,探討動(dòng)物和植物的起源,以及物種間的親緣關(guān)系等都具有重要意義。
主要觀察染色體的長(zhǎng)短,著色點(diǎn)的位置,臂的長(zhǎng)短有無(wú)隨體等。
根據(jù)丹佛(1960)倫敦(1963)和芝加哥(1966)會(huì)議提出的標(biāo)準(zhǔn),按照染色體的長(zhǎng)度一次減少和著色粒的位置以及其他特征,可以把人類體細(xì)胞染色體分為七群;A,B,C,D,E,F,G.對(duì)于任何一個(gè)染色體的基本形態(tài)特征來(lái)說(shuō),重要的參數(shù)有以下3個(gè):
(1)相對(duì)長(zhǎng)度:指單個(gè)染色體長(zhǎng)度與包括X或Y染色體在內(nèi)的單倍染色體總長(zhǎng)之比;(2)臂指數(shù):指長(zhǎng)臂同短臂的比率
(3)著絲粒指數(shù):指短臂占該染色體長(zhǎng)度的比(反映著絲粒位置的指數(shù))分組排隊(duì)原則
著絲粒類型相同,相對(duì)長(zhǎng)度相近的分一組同一組的按染色體長(zhǎng)短順序配對(duì)排列各指數(shù)相同的染色體配為一對(duì)可根據(jù)隨體的有無(wú)進(jìn)行配對(duì)
將染色體按長(zhǎng)短排隊(duì),短臂向上。染色體編號(hào)
記述一特定帶時(shí),需要寫明3個(gè)內(nèi)容:染色體號(hào),長(zhǎng)短臂,區(qū)的序號(hào)。這些內(nèi)容按順序?qū),不用間隔或加標(biāo)點(diǎn)。組型描述
首先列出染色體總數(shù),然后是性染色體組成,接著列出異常的染色體數(shù)目或形態(tài)。
實(shí)驗(yàn)感想
首先感謝老師的指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的幫助。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)認(rèn)識(shí)到科學(xué)實(shí)驗(yàn)探究是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,它需要集眾人之力,需要端正的態(tài)度,通過(guò)團(tuán)隊(duì)的不懈努力才能分享成功的喜悅。本次自主實(shí)驗(yàn)鞏固了我們?cè)趯?shí)驗(yàn)課上學(xué)習(xí)的細(xì)胞培養(yǎng)、染色體制備等內(nèi)容,讓我們對(duì)其原理和操作技能有了更進(jìn)一步的了解和掌握。此外,自主實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)了我們自主探究、科學(xué)探究的能力,提升了小組成員之間分工合作的意識(shí),還有提升了我們?nèi)穗H關(guān)系意識(shí)。
建議
建議老師,下次匯報(bào)時(shí)間安排做完試驗(yàn)后的周末。
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第三章
細(xì)胞生物學(xué)研究方法
METHODSANDTECHNIQUES第二版和第三版P49
從整個(gè)生命科學(xué)的發(fā)展趨勢(shì)看細(xì)胞生物學(xué)研究分子水平細(xì)胞水平結(jié)構(gòu)功能細(xì)胞生命活動(dòng)分析綜合
整個(gè)生命科學(xué)的發(fā)展最終是要解釋生命的活動(dòng)規(guī)律,而生命的活動(dòng)規(guī)律要到細(xì)胞中去尋找。而要了解細(xì)胞的活動(dòng)規(guī)律,我們要在分子水平細(xì)胞內(nèi)各種生物分子的代謝規(guī)律,這就需要研究細(xì)胞內(nèi)的各種組分
另外我們還要了解細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,2
由于課時(shí)所限,我們不可能所有的方法都詳細(xì)講解。3
Mainpoint
第一節(jié)顯微技術(shù)(細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察技術(shù))一、光學(xué)顯微鏡二、電子顯微鏡三、顯微操作技術(shù)第二節(jié)細(xì)胞分離技術(shù)
第三節(jié)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)第四節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交本章重點(diǎn):
1.掌握細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法(主要是光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡);2.掌握細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程的基本技術(shù);3.了解細(xì)胞組分的分析方法。第一節(jié)顯微技術(shù)
工具是人類器官的延伸。顯微鏡300多年的改進(jìn)是從器具和觀察對(duì)象兩方面著手提高放大倍數(shù)和增加分辨細(xì)微結(jié)構(gòu)的能力。
在器具上,包括選擇投射于物體上的波束的性質(zhì)及為便于觀察而不斷改善操縱裝置;在觀察對(duì)象上,則是如何突顯待觀察的部分。波束有光波和電磁波,
光學(xué)顯微鏡:以可見(jiàn)光(或紫外線)為光源。電子顯微鏡:以電子束為光源。第一節(jié)顯微技術(shù)
、光學(xué)顯微鏡(TheLightMicroscopy)(一)普通光學(xué)顯微鏡駱駝刺根尖染色體
對(duì)二氯苯飽和溶液處理9
光學(xué)顯微鏡是如何作到這一點(diǎn)的?(一)普通光學(xué)顯微鏡可變光闌管鏡目鏡
2.原理:經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像,經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。放大率(magnification):最終成像的大小與原物體大小的比值;分辨率/力(Resolution):分辨或區(qū)分兩質(zhì)點(diǎn)間最小距離。(一)普通光學(xué)顯微鏡
3.分辨力:指分辨物體最小間隔的能力。D=0.61λ/Nsinθ
其中λ為入射光線波長(zhǎng);N=介質(zhì)折射率;
Nsinθ=鏡口率(低倍鏡0.28,高倍鏡0.65,油鏡1.25.
2θ=鏡口角(樣品對(duì)物鏡鏡口的張角);
通常2θ最大值可達(dá)140度,空氣N=1,D約0.3um。
油鏡N=1.5,此時(shí)分辨率D可達(dá)0.2um,思考:如何提高顯微鏡的分辨能力?12
表一、幾種介質(zhì)的折射率(二)相差顯微鏡
Figure3-2.Interferencebetweenlightwaves.Whentwolightwavescombineinphase,theamplitudeoftheresultantwaveislargerandthebrightnessisincreased.Twolightwavesthatareoutofphasepartiallycanceleachotherandproduceawavewhoseamplitude,andthereforebrightness,isdecreased.A+/B+
相位板(annularphaseplate)在物鏡中加了涂有氟化鎂,可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種:
1.A+相板:將直射光推遲1/4λ,兩組光波合軸后光波相加,振幅加大,標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮,形成亮反差(或稱負(fù)反差)。
2.B+相板:將衍射光推遲1/4λ,兩組光線合軸后光波相減,振幅變小,形成暗反差(或稱正反差),結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。(二)相差顯微鏡基本原理:
利用光的衍射和干涉現(xiàn)象,把光程差變成振幅差(即明暗)。從而提高各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度,明者更明,暗者更暗,立體感增強(qiáng),使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見(jiàn)。故樣品不需染色,適合觀察活細(xì)胞。(二)相差顯微鏡
與普通光學(xué)顯微鏡相比有兩個(gè)特殊之處:相位板
環(huán)形光闌(位于光源與聚光器之間,作用是使透過(guò)聚光器的光線形成空心光錐,焦聚到標(biāo)本上。
使用時(shí),環(huán)狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌,它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。其作用是將直射光所形成的像從一些衍射旁像中分出來(lái)。
用途:可觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本,活細(xì)胞動(dòng)態(tài),有時(shí)也可用于觀察缺少反差的染色樣品。(三)微分干涉差顯微鏡(DIC)
原理:利用兩組平面偏振光的干涉。光線經(jīng)棱鏡折射后分成兩束,分裂出來(lái)的光束的振動(dòng)方向相互垂直且強(qiáng)度相等,光束分別在距離很近的兩點(diǎn)上通過(guò)被檢物體,在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小,而不出現(xiàn)重影現(xiàn)象,使圖象呈現(xiàn)出立體的三維感覺(jué)。20
平面偏振光光是一種電磁波,光振動(dòng)的方向與它前進(jìn)的方向垂直;A(chǔ)知識(shí)
樣品經(jīng)過(guò)微分干涉差顯微鏡,厚度上的微小差異就轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別,增加反差,加強(qiáng)影像的明暗效果。
標(biāo)本可略厚一點(diǎn),折射率差別更大,故影像的立體感更強(qiáng)。
用途:微分干涉差顯微鏡用于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器,與錄像設(shè)備結(jié)合,可觀察活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)。DIC顯微鏡下的硅藻(偽彩色)
(A)普通明視場(chǎng)顯微鏡下的纖維原細(xì)胞(B)相差顯微鏡下的纖維原細(xì)胞,(C)微分干涉顯微鏡下的纖維原細(xì)胞(D)普通暗視場(chǎng)顯微鏡下的纖維原細(xì)胞.23
微分干涉差顯微鏡原生動(dòng)物[阿米巴變形蟲(chóng)的顯微照片。進(jìn)行人工上色的三維圖像展示了豐富的細(xì)節(jié)。細(xì)胞中有些物質(zhì),如葉綠體等,受紫外線照射后可發(fā)熒光;另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光,但如果用熒光染料(酸性品紅、啶橙,中性紅、甲基綠)或熒光抗體染色后,經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光,熒光顯微鏡不僅對(duì)這類物質(zhì)可進(jìn)行定性、定量和定位研究,還可觀察其形狀及在細(xì)胞內(nèi)的變化。
(四)熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope
Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色
還可進(jìn)行免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。圖像清晰,色彩逼真。
(四)熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope特點(diǎn):
1.光源為紫外線,波長(zhǎng)較短,分辨力高于普通顯微鏡;2.有兩個(gè)特殊的濾光片;3.照明方式通常為落射式。27
熒光顯微鏡是在光鏡水平對(duì)特異蛋白質(zhì)等生物大分子定性定位的最有力的工具。免疫熒光技術(shù)
熒光素直接標(biāo)記技術(shù)
GFP基因與某種蛋白基因融合,可直接觀察該蛋白的動(dòng)態(tài)變化。28
第一套濾光片為激發(fā)光濾片,裝在光源和樣品之間,只有能激發(fā)熒光染料發(fā)光的特定波長(zhǎng)才能通過(guò)。
第二套為阻斷濾片,裝在物鏡和目鏡之間,只讓染料所發(fā)出的熒光通過(guò)。這樣,在黑暗背景襯托下,很容易觀測(cè)到發(fā)出熒光的樣品。beam-splittingmirror(半透射反射鏡):傾斜的、透明的鏡子,使光垂直地反射到觀察者的眼中。
Figure3-8.Fluorescentdyes.Thestructuresoffluoresceinandtetramethylrhodamine,twodyesthatarecommonlyusedforfluorescencemicroscopy.Fluoresceinemitsgreenlight,whereastherhodaminedyeemitsredlight.熒光素羅丹明
(五)激光共聚焦掃描顯微境
Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM
原理:一束光線通過(guò)聚焦成點(diǎn),在樣品表面掃描后成象。因?yàn)樵谝粋(gè)時(shí)間試樣上只有一個(gè)點(diǎn)被照亮。隨著試樣被掃描,像素的積累便構(gòu)成了圖像。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦,掃描限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時(shí),就可以獲得樣品不同深度層次的圖像,這些分層圖像再由計(jì)算機(jī)重構(gòu)成三維圖像。LCSM的原理:物鏡成像透鏡
共焦點(diǎn)是指物鏡和聚光鏡同時(shí)聚焦到同一小點(diǎn)。它在某一瞬間只用一束通過(guò)檢測(cè)器前的小孔的光成像,可顯著提高分辨率?梢杂^察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。
樣品制備無(wú)特殊要求;各種染色、非染色、熒光標(biāo)記的組織(包括活組織)、培養(yǎng)細(xì)胞、粘附細(xì)胞、細(xì)胞涂片、石蠟切片、冰凍切片。激光共聚焦掃描顯微境特點(diǎn)與用途:特點(diǎn):
用激光作光源,逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。用途:
亞細(xì)胞定位及動(dòng)態(tài)變化。
能掃描不同層次,重構(gòu)出樣品的三維結(jié)構(gòu)(立體圖像)?筛淖冇^察的焦平面,因而能進(jìn)行“光學(xué)切片”,觀察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。爪蟾黑色素細(xì)胞LCSM照片,藍(lán)色為細(xì)胞核,綠色為微管
共聚焦顯微鏡由于可以自動(dòng)改變觀察的焦平面,因此縱向分辨率得到改善。分辨率越高,意味著可使用的點(diǎn)數(shù)越多,圖像越細(xì)致。
受精5天后的卵子,一些精細(xì)胞仍粘貼在它表面。胚胎和精細(xì)胞核呈紫色,而精子的尾巴是綠色。藍(lán)色區(qū)域是縫隙連接,它們把細(xì)胞彼此聯(lián)系在一起。果蠅原腸胚表層細(xì)胞質(zhì)內(nèi)免疫熒光標(biāo)記的微絲A.免疫熒光技術(shù)B.LCSM36
GFP標(biāo)記的鼠神經(jīng)中樞干細(xì)胞移入剛出生的小老鼠的腦內(nèi),已經(jīng)開(kāi)始形成少突細(xì)胞和星細(xì)胞!
Figure3-3.Edgeeffects.Theinterferenceeffectsobservedathighmagnificationwhenlightpassestheedgesofasolidobjectplacedbetweenthelightsourceandtheobserver.(六)暗視野顯微鏡darkfieldmicroscope38
光學(xué)上的丁達(dá)爾現(xiàn)象(六)暗視野顯微鏡darkfieldmicroscope聚光鏡中央有擋光片,照明光線不直接進(jìn)入物鏡,只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡,因而視野的背景是黑的,物體的邊緣是亮的。
應(yīng)用:觀察未經(jīng)染色4~200nm的活體或膠體粒子。(核、線粒體),分辨率比普通顯微鏡高50倍。
(a)梅毒螺旋體,暗視野。
(b)團(tuán)藻屬和水棉屬的綠藻;暗視野。
(c)迂回螺菌具有束狀鞭毛的一種個(gè)體很大的細(xì)菌。相差。(d)肉毒梭菌,它具有近端生卵形內(nèi)生孢子;相差。
(e)草履蟲(chóng)染色后觀察到的中央大核和在其邊上的球形小核;相差。abcde
(七)倒置顯微鏡inversemicroscope
物鏡與照明系統(tǒng)顛倒,物鏡在載物臺(tái)之下,照明系統(tǒng)在載物臺(tái)之上,用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)用于研究生物大分子之間的距離和相互作用。
傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的研究方法都要破碎細(xì)胞或?qū)?xì)胞造成損傷,無(wú)法做到在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下實(shí)時(shí)的對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究。熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)技術(shù)的應(yīng)用結(jié)合基因工程等技術(shù)正好彌補(bǔ)了這一缺陷,該技術(shù)可用于研究活細(xì)胞生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用。
(八)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(fluorescenceresonanceenergytransfer,F(xiàn)RET)43
(八)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(fluorescenceresonanceenergytransfer,F(xiàn)RET)
以GFP的兩個(gè)突變體CFP、YFP為例簡(jiǎn)要說(shuō)明其原理:
CFP的發(fā)射光譜與YFP的吸收光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B,當(dāng)它們足夠接近時(shí)(10nm范圍內(nèi)),用CFP的吸光激發(fā),其發(fā)色基團(tuán)將會(huì)把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至YFP的發(fā)色基團(tuán)上,所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失,主要發(fā)射將是YFP的熒光。兩個(gè)發(fā)色基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)換效率與它們之間的空間距離的6次方成反比,對(duì)空間位置的改變非常靈敏。
熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)就是采用非放射方法,在供體和受體相互靠得很近(bYFPaaexemexem
蛋白質(zhì)a與b之間的相互作用46
例如要研究?jī)煞N蛋白質(zhì)a和b間的相互作用,可以根據(jù)FRET原理構(gòu)建融合蛋白,這種融合蛋白由三部分組成:CFP、蛋白質(zhì)b、YFP。用CFP吸收波長(zhǎng)433nm作為激發(fā)波長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)靈巧設(shè)計(jì),使當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與b沒(méi)有發(fā)生相互作用時(shí),CFP與YFP相距很遠(yuǎn)不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,因而檢測(cè)到的是CFP的發(fā)射波長(zhǎng)為476nm的熒光;但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與b發(fā)生相互作用時(shí),由于蛋白質(zhì)b受蛋白質(zhì)a作用而發(fā)生構(gòu)象變化,使CFP與YFP充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,此時(shí)檢測(cè)到的就是YFP的發(fā)射波長(zhǎng)為527nm的熒光。將編碼這種融合蛋白的基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá),這樣就可以在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用。
(九)熒光漂白恢復(fù)技術(shù)(FRAP)用途:主要檢測(cè)活體細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部的分子運(yùn)動(dòng)以及在各種結(jié)構(gòu)上分子動(dòng)態(tài)變化率的大小。
原理:將大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì)或脂質(zhì))耦聯(lián)上親脂性或者親水性的熒光分子(如熒光素或綠色熒光蛋白),采用高能量激光束照射特定的區(qū)域,是該區(qū)域熒光發(fā)生不可逆淬滅,但由于分子運(yùn)動(dòng),其它區(qū)域攜帶熒光的生物大分子會(huì)移向淬滅區(qū),從而恢復(fù)熒光漂白;謴(fù)的時(shí)間與運(yùn)動(dòng)速度有關(guān)。當(dāng)代顯微鏡的發(fā)展趨勢(shì)
采用組合方式,集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體。自動(dòng)化與電子化。光鏡標(biāo)本的制備以石蠟切片為例:
材料處理固定脫水包埋切片染色觀察
染色劑:普通染色劑,熒光染色劑二、電子顯微鏡
(一)透射電子顯微鏡(二)掃描電子顯微鏡1.原理
電子束的波長(zhǎng)短,并且波長(zhǎng)與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。52
掃描電鏡:20世紀(jì)60年代問(wèn)世,用來(lái)觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。分辨力為5~10nm。
有效放大倍率為0.2mm/10nm=201*0X
工作原理:是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品,在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子,次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān),次級(jí)電子由探測(cè)器收集,信號(hào)經(jīng)放大用來(lái)調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度,顯示出與電子束同步的掃描圖像。表1、不同光線的波長(zhǎng)2.Resolution
肉眼:0.2mm;光學(xué)顯微鏡:0.2um;電子顯微鏡,0.2nm分辨力與分辨率并不等同。
2.電鏡的結(jié)構(gòu):電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)。3.用途:用于觀察超微結(jié)構(gòu)(ultrastructure),即小于0.2m、光學(xué)顯微鏡下無(wú)法看清的結(jié)構(gòu),又稱亞顯微結(jié)構(gòu)。電子顯微鏡透射電子顯微鏡
TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE,TEM
為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子,標(biāo)本在固定、脫水后,要噴涂上一層重金屬膜,重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。Scanningelectronmicroscope(SEM)表2、電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的比較
光學(xué)顯微鏡電子顯微鏡發(fā)光源燈泡電子槍光源可見(jiàn)光、紫外電子束光透鏡玻璃透鏡電磁透鏡真空系統(tǒng)空氣真空成象色彩彩色單色樣品要求無(wú)需脫水需脫水成像原理利用樣品對(duì)光利用樣品對(duì)的吸收形成明電子的散射暗反差和顏色和透射形成變化
明暗反差2、電子顯微鏡用到的一些技術(shù)(1)超薄切片技術(shù)
電子束穿透力很弱,用于電鏡觀察的標(biāo)本須制成厚度僅40-~50nm的超薄切片,用超薄切片機(jī)(ultramicrotome)制作。
這就要求樣品具有一定的剛性和韌性,SpecimenPreparationforElectronMicroscopy
通常以鋨酸和戊二醛固定樣品,丙酮逐級(jí)脫水。以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片,厚度:40-50nm石蠟切片的厚度:3-10um;SectionsofLM:>5um;SectionsofTEM:復(fù)膜顯示出了標(biāo)本蝕刻面的形態(tài),在電鏡下得到的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞斷裂面處的結(jié)構(gòu)。主要用來(lái)觀察胞質(zhì)中的細(xì)胞骨架纖維及其結(jié)合蛋白。培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)面的深度蝕刻電鏡照片,網(wǎng)格蛋白衣被
Figure3-22.Three-dimensionalreconstructionfromserialsections.Singlethinsectionssometimesgivemisleadingimpressions.Inthisexamplemostsectionsthroughacellcontainingabranchedmitochondrionwillappeartocontaintwoorthreeseparatemitochondria.Sections4and7,moreover,mightbeinterpretedasshowingamito-chondrionintheprocessofdividing.Thetruethree-dimensionalshape,however,canbereconstructedfromserialsections.(4)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)研究生物大分子三維結(jié)構(gòu):
通過(guò)電鏡技術(shù),從不同側(cè)面,不同層次獲得生物大分子的照片,經(jīng)傅里葉轉(zhuǎn)化,展示生物大分子的三維結(jié)構(gòu)。
生物大分子三維結(jié)構(gòu)是當(dāng)今生命科學(xué)研究的核心課題之一。(5)低溫電鏡技術(shù):
近幾年發(fā)展起來(lái)的,樣品不固定、不染色、不干燥,直接包埋在100nm的冰膜包埋,電鏡內(nèi)-160℃,用相位襯度成像。展示生物大分子及其復(fù)合物表面與內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu),具更高分辨率。艾滋病毒
(6)掃描電子顯微鏡SEM
電子“探針”掃描,激發(fā)樣品表面放出二次電子,探測(cè)器收集二次電子成象。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子,標(biāo)本在固定、脫水后,要噴涂上一層重金屬膜,重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。
次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān),次級(jí)電子由探測(cè)器收集,信號(hào)經(jīng)放大用來(lái)調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度,顯示出與電子束同步的掃描圖像。CO2臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張力問(wèn)題。血管破裂,一個(gè)個(gè)紅血球細(xì)胞正在慢慢的從破裂的血管流出酵母第三章
細(xì)胞生物學(xué)研究方法
METHODSANDTECHNIQUES第二版和第三版P49肺氣泡肺癌細(xì)胞74
肺氣泡是血液交換氣體的地方。(三)掃描隧道顯微鏡
scanningtunnelingmicroscope,STM原理:量子力學(xué)的隧道效應(yīng),當(dāng)針尖在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí),此處電子云重疊,外加一低電壓(2mV~2V),針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系,將掃描過(guò)程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像,即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率很高:橫向?yàn)?.1~0.2nm,縱向可達(dá)0.001nm。優(yōu)點(diǎn):三態(tài)(固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài))物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。
STMimage,BenzenemoleculesaccumulateatstepedgesonCu掃描隧道顯微鏡不僅僅只用于觀察單個(gè)的原子,還可通過(guò)顯微鏡的尖端、一些精良的刻度尺和穩(wěn)定的手來(lái)操縱單個(gè)的原子,如挑選原子或?qū)⑺鼈儚囊贿呁频搅硪贿!皰呙杷淼里@微鏡是一次一個(gè)人操縱原子的首個(gè)最好的工具!蓖ㄟ^(guò)此辦法,成功將12個(gè)溴原子通過(guò)分子的自我組合排成一個(gè)圓圈。三、顯微操作技術(shù)
micromanipulationtechnique
在倒置顯微鏡下利用顯微操作儀進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作儀是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動(dòng)的機(jī)械裝置。
顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。
細(xì)胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史,Gordon等人(1962)對(duì)非洲爪蟾進(jìn)行核移植獲得成功。我國(guó)著名學(xué)者童第周等上個(gè)世紀(jì)70年代在魚(yú)類細(xì)胞核移植方面進(jìn)行了許多工作,并取得了豐碩成果。
Thetechniqueforthetakeapartandgatherupofcell,andmicroscopemanipulation
PreparationandreformofkaryoplastandcytoplastTransgenicanimalsandplantsTransgenicmice10weeks44gand29g
克隆技術(shù)不僅對(duì)胚胎學(xué)、發(fā)育遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)有重大意義,而且也有巨大的經(jīng)濟(jì)潛力。首先克隆技術(shù)可用于器官移植,造福人類;也可改良物種,給畜牧業(yè)帶來(lái)好處。另外,克隆技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合,可大批量“復(fù)制”含有可產(chǎn)生藥物原料的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,從而使克隆技術(shù)更好地為人類服務(wù)。我國(guó)有關(guān)科學(xué)家提出應(yīng)明確禁止克隆技術(shù)應(yīng)用于人類,否則將產(chǎn)生一系列倫理學(xué)、法律學(xué)等的災(zāi)難性問(wèn)題。電子顯微鏡能否代替光學(xué)顯微鏡?電子顯微鏡用電子束代替了光束,大大提高了分辨率,電子顯微鏡相對(duì)光學(xué)顯微鏡是個(gè)飛躍。但是
電子顯微鏡:1.樣品制備更加復(fù)雜;2.鏡筒需要真空,成本更高;3.只能觀察“死”的樣品,不能觀察活細(xì)胞。光學(xué)顯微鏡:1.技術(shù)性能要求不高,使用容易;2.可以觀察活細(xì)胞,觀察視野范圍廣,可在組織內(nèi)觀察細(xì)胞間的聯(lián)系;3.而且一些新發(fā)展起來(lái)的光學(xué)顯微鏡能夠觀察特殊的細(xì)胞或細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分。因此,電子顯微鏡不能完全代替光學(xué)顯微鏡。第二節(jié)細(xì)胞分離技術(shù)
Figure3-31.Afluorescence-activatedcellsorter.當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)激光束時(shí),根據(jù)細(xì)胞是否帶有熒光,包含有單個(gè)細(xì)胞的液滴被帶上正或負(fù)電荷。接下來(lái)這個(gè)液滴在電場(chǎng)作用下被收集到試管中。
注意:細(xì)胞的濃度必須調(diào)整到絕大多數(shù)液滴都不包含多個(gè)細(xì)胞,多個(gè)細(xì)胞的液滴不帶電荷而流入廢液杯中。流式細(xì)胞儀一、細(xì)胞的分離
二、細(xì)胞組分分離技術(shù)
1.Thetechniqueofdifferentialcentrifugation
Step-by-stepprocedureforthepurificationoforganellesbydifferentialcentrifugation.S=(dx/dt)/2x=110-13sec.密度
Figure3-34.Thepreparativeultracentrifuge.
轉(zhuǎn)速為1~2.5萬(wàn)rpm的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。
轉(zhuǎn)速>2.5萬(wàn)rpm,離心力>8.9萬(wàn)g,稱為超速離心機(jī)。
目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100000r/min,離心力超過(guò)500000g。(一)差速離心Differentialcentrifugation特點(diǎn):
介質(zhì)密度均一;
速度由低向高,逐級(jí)離心。
用途:分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降順序:核葉綠體線粒體溶酶體與過(guò)氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體。
可將細(xì)胞器初步分離,常需進(jìn)一步通過(guò)密度梯離心再行分離純化。
Figure3-36.Comparisonofmethodsofvelocitysedimentationandequilibriumsedimentation.(二)密度梯度離心
A.速度沉降velocitysedimentationB.等密度沉降isopycnicsedimentation
用途:分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。特點(diǎn):介質(zhì)密度較低,介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。
原理:介質(zhì)密度梯度平緩,分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。用途:分離密度不等的顆粒。
特點(diǎn):介質(zhì)密度較高,陡度大,介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度。所需的力場(chǎng)通常比速率沉降法大10~100倍,往往需要高速或超速離心。原理:樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處,并停留在那里達(dá)到平衡,從而將不同密度的成分分離。
Figure3-37.Theseparationofsmallmoleculesbypaperchromatography.樣品點(diǎn)到層析慮紙的一端并且吹干,包含兩個(gè)以上試劑的液滴可通過(guò)毛細(xì)管作用緩慢移動(dòng)。樣品中的不同組分移動(dòng)速率不同。
2.Paperchromatography紙層析法又稱紙色譜法88
將紙取出,待溶劑揮發(fā)后,用顯色劑或其他適宜方法確定斑點(diǎn)位置。
Figure3-38.Theseparationofmoleculesbycolumnchromatography.層析柱有玻璃和塑料柱兩種,內(nèi)填有可滲透的固體基質(zhì),如纖維素,而且基質(zhì)也被溶劑浸潤(rùn)。樣品放在柱子的最上端,然后大量的溶劑從上端緩慢流過(guò)柱子,樣品中不同的成分的遷移率不同,從而被分開(kāi),從柱子下端流入不同的試管。3.Columnchromatography
Figure3-39.Threetypesofmatricesusedforchromatography.離子交換柱(A)是一種帶有電荷的基質(zhì),它可保留帶有相反電荷的分子,常用來(lái)分離蛋白質(zhì),通常所用基質(zhì)為DEAE-cellulose,帶正電;CM-celluloseandphosphocellulose,帶負(fù)電。凝膠過(guò)濾柱(B)的基質(zhì)是惰性而多空的。比較小的分子因滲透到基質(zhì)中而移動(dòng)緩慢,較大的分子則從基質(zhì)分子的空隙中較快的分離出來(lái)。親和層析柱(C)的基質(zhì)分子上連接有一個(gè)特殊的配體,如抗體或酶基團(tuán),這些基團(tuán)可以與特殊的分子結(jié)合,然后在洗脫下來(lái)。
Figure3-41.Thedetergentsodiumdodecylsulfate(SDS)andthereducingagentbeta-mercaptoethanol.ThesetwochemicalsareusedtosolubilizeproteinsforSDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis.TheSDSisshownhereinitsionizedform.4.SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis
Figure3-42.SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis(SDS-PAGE).Electrophoresis
Figure3-44.Separationofproteinmoleculesbyisoelectricfocusing.AtlowpHthecarboxylicacidgroupsofproteinstendtobeuncharged(-COOH)andtheirnitrogen-containingbasicgroupsfullycharged(-NH3+),givingmostproteinsanetpositivecharge.AthighpHthecarboxylicacidgroupsarenegativelycharged(-COO-)andthebasicgroupstendtobeuncharged(-NH2),givingmostproteinsanetnegativecharge.AtitsisoelectricpHaproteinhasnonetchargesincethepositiveandnegativechargesbalance.Thus,whenatubecontainingafixedpHgradientissubjectedtoastrongelectricfieldintheappropriatedirection,eachproteinspeciespresentwillmigrateuntilitformsasharpbandatitsisoelectricpH,asshown.等電點(diǎn)聚焦電泳
Figure3-45.Two-dimensionalpolyacrylamide-gelelectrophoresis.AlltheproteinsinanE.colibacterialcellareseparatedinthisgel,inwhicheachspotcorrespondstoadifferentpolypeptidechain.Notethatdifferentproteinsarepresentinverydifferentamounts.Thebacteriawerefedwithamixtureofradioisotope-labeledaminoacidsandtheresultwasdetectedbyauto-radiography.(CourtesyofPatrickO"Farrell.)第三節(jié)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)
組織化學(xué)或細(xì)胞化學(xué)染色:是利用染色劑可同細(xì)胞的某種成分發(fā)生反應(yīng)而著色的原理,對(duì)某種成分進(jìn)行定性或定位研究的技術(shù)。
利用這種方法對(duì)細(xì)胞的各種成分幾乎都能顯示,包括無(wú)機(jī)物、醛、蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸、酶等。
二、細(xì)胞組分的顯示方法DNA的顯示方法:
1.甲基綠和毗羅紅兩種染色劑對(duì)DNA和RNA的親和力不同,甲基綠使DNA呈現(xiàn)綠色,毗羅紅使RNA呈現(xiàn)紅色。
2.Schiff反應(yīng):Schiff試劑即亞硫酸品紅溶液,HO3S-C-(-C6H5-NH2)3,與細(xì)胞中的醛基(DNA或多糖)反應(yīng)呈現(xiàn)紅色。96
甲基綠和毗羅紅兩種染色劑對(duì)DNA和RNA的親和力不同,甲基綠使DNA呈現(xiàn)綠色,毗羅紅使RNA呈現(xiàn)紅色。利用甲基綠、毗羅紅混合染色劑將細(xì)胞染色,可以顯示DNA和RNA在細(xì)胞中的分布。鹽酸能夠改變細(xì)胞膜的通透性,加速染色劑進(jìn)人細(xì)胞,同時(shí)使染色體中的DNA與蛋白質(zhì)分離,有利于DNA與染色劑結(jié)合。
DNA分子結(jié)構(gòu)中帶有醛基-CHO,用HCl水解可使醛基釋放,再以無(wú)色的亞硫酸品紅液(Schiff)染色使醛基與亞硫酸品紅結(jié)合,呈現(xiàn)紫紅色,這是DNA特有的顯色反品紅溶液通入二氧化硫得到的無(wú)色物質(zhì),又名希夫(Schiff)試劑,遇醛顯紅色,遇酮不變色,可以區(qū)別醛和酮這是分子HO3S-C-(-C6H5-NH2)RNA被酸水解后降解。97
二、細(xì)胞組分的顯示方法蛋白質(zhì)的顯示方法:
用于蛋白質(zhì)的定性和定位。
1.米倫(Millon)反應(yīng)→顯示酪氨酸的方法蛋白質(zhì)上酪氨酸+氮汞試劑→紅色沉淀2.重氮反應(yīng)
[原理]芳香伯胺與亞硝酸作用,在酸性,低溫下(<5℃)可生成重氮鹽,即四氮鹽。在堿性條件下,四氮鹽與組氨酸,色氨酸及酪氨酸的苯環(huán)結(jié)合產(chǎn)生偶聯(lián)反應(yīng)形成有色復(fù)合物。98
四氮化聯(lián)鄰茴香胺法(Tetra-azotized-o-anisidine)[應(yīng)用]廣泛應(yīng)用于顯示酶的活性
[原理]芳香伯胺與亞硝酸作用,在低溫下(<5℃)可生成重氮鹽,此即重氮反應(yīng).重氮鹽可與酚類作用生成有色化合物偶氮化合物.上述反應(yīng)必須在酸性條件下進(jìn)行.本實(shí)驗(yàn),聯(lián)鄰茴香胺在酸性,低溫條件下與亞硝酸作用生成四氮鹽.四氮鹽有兩個(gè)重氮鹽,其中一個(gè)重氮基在堿性條件下與所要顯示的組氨酸,色氨酸及酪氨酸的苯環(huán)結(jié)合產(chǎn)生偶聯(lián)反應(yīng),另一個(gè)重氮基與酚類或奈類發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)以增色.因此,可以用生成的偶氮染料來(lái)代表組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量.二、細(xì)胞組分的顯示方法多糖的顯示方法:
高碘酸雪夫法(PAS法):
[原理]高碘酸為強(qiáng)氧化劑,它可以氧化多糖分子內(nèi)1,2乙二醇(順式和反式)而產(chǎn)生醛基,此醛基再與Schiff試劑結(jié)合即產(chǎn)生紅紫色。99
中性多糖糖原
碳水化合物酸性多糖硫酸軟骨素A,B,C,肝素,硫酸角(組織中多糖類)質(zhì)素,透明質(zhì)酸等
蛋白多糖粘蛋白,唾酸粘蛋白糖脂腦苷脂類
※組織中糖的種類較多,因此,要特異性地顯示各種糖類必須用抑制和酶水解來(lái)對(duì)照實(shí)驗(yàn).二、細(xì)胞組分的顯示方法細(xì)胞內(nèi)脂類染色:
用易溶于脂類的染料,使之溶于所檢的脂質(zhì)(如脂滴)中,使組織內(nèi)的脂類著色。如:四氧化鋨與不飽和脂肪酸反應(yīng)呈黑色,蘇丹Ⅲ與脂滴反應(yīng)呈深紅色。100
二、細(xì)胞組分的顯示方法細(xì)胞堿性磷酸酶:底物:甘油磷酸酯反應(yīng)產(chǎn)物:磷酸根再加入:鉛鹽或鈷鹽
產(chǎn)生:磷酸鉛或磷酸鈷無(wú)色沉淀再加入:硫化銨產(chǎn)生:有色沉淀1102
根據(jù)免疫學(xué)原理,利用抗體同特定抗原專一結(jié)合,對(duì)抗原進(jìn)行定位測(cè)定的技術(shù)。常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。(二)植物細(xì)胞培養(yǎng)
外植體培養(yǎng):誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織。用于研究植物的生長(zhǎng)發(fā)育、分化和變異;進(jìn)行無(wú)性繁殖;制取代謝產(chǎn)物。
懸浮細(xì)胞培養(yǎng):適合于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng),制取植物代謝產(chǎn)物。原生質(zhì)體培養(yǎng):培養(yǎng)脫壁后的細(xì)胞,特點(diǎn):①比較容易攝取外來(lái)的遺傳物質(zhì),如DNA;②便于進(jìn)行細(xì)胞融合,形成雜交細(xì)胞;
③適宜條件下可產(chǎn)生細(xì)胞壁,經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。單倍體培養(yǎng):通過(guò)花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株。二、細(xì)胞融合
同核體:相同基因型的細(xì)胞融合而成。異核體:不同基因型的細(xì)胞融合而成。
自發(fā)融合:同種細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中自發(fā)合并的現(xiàn)象。誘發(fā)融合:異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合。
誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法:生物方法(仙臺(tái)病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒)、化學(xué)方法(聚乙二醇PEG)、物理方法(電擊和激光)。單克隆抗體技術(shù)
正常淋巴細(xì)胞(如小鼠脾細(xì)胞)具有分泌抗體的能力,但不能長(zhǎng)期培養(yǎng),瘤細(xì)胞(如骨髓瘤)可以在體外長(zhǎng)期培養(yǎng),但不分泌抗體。于是英國(guó)人Kohler和Milstein1975將兩種細(xì)胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù),獲1984年諾貝爾獎(jiǎng)。單克隆抗體技術(shù)主要作用
用單克隆抗體代替多克隆抗體克服了交叉反應(yīng),提高了免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的特異性和敏感性,從而促進(jìn)了醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)的發(fā)展;
用單克隆作親和柱,可分離提純含量極低的可溶性的抗原,如激素,細(xì)胞因子和難以純化的腫瘤抗原等,為物質(zhì)提純開(kāi)辟了一條新途徑;
制備的單克隆抗體識(shí)別細(xì)胞表面特異性受體,若將抗腫瘤藥物(如毒素或放射性物質(zhì))偶連到其上,構(gòu)建生物導(dǎo)彈,有望攻克人類頑疾--腫瘤。
單克隆抗體有廣闊的發(fā)展前景,但有其局限性。單克隆抗體作為外源性的抗原,多次反復(fù)的注射后能促使機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答,產(chǎn)生相應(yīng)的抗抗體,產(chǎn)生排斥現(xiàn)象,因此單克隆抗體應(yīng)用于臨床有其風(fēng)險(xiǎn)性,在緊急預(yù)防的情況下,可以慎用。
總之,單克隆抗體為人類在檢驗(yàn)疾病、治療疾病方面取得了重大突破,盡管它還有些弊端,相信在不久的將來(lái)人類會(huì)制備出更加優(yōu)良的單克隆抗體,為攻克腫瘤作出更大的貢獻(xiàn)!第四節(jié)模式生物模式生物的特點(diǎn)有:
1)生理特征能夠代表生物界的某一大類群;2)容易獲得并易于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)繁殖;3)容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,特別是遺傳學(xué)分析。1海膽
最早被使用的模式生物,主要用于早期發(fā)育生物學(xué)(受精,早期胚胎發(fā)育)。
1891年,HansDriesh在顯微鏡下把剛剛完成第一次卵裂的海膽胚胎一分為二,發(fā)現(xiàn)分開(kāi)后的兩個(gè)細(xì)胞各自形成了一個(gè)完整幼蟲(chóng),證明了胚胎具有調(diào)整發(fā)育的能力。為現(xiàn)代發(fā)育生物學(xué)奠定了第一塊觀念里程碑。2病毒
基因組小,易于遺傳操作,可作為外源基因載體。3細(xì)菌大腸桿菌
培養(yǎng)簡(jiǎn)單易于操作,繁殖能力強(qiáng),繁殖時(shí)間短等因素,常作為實(shí)驗(yàn)材料,在遺傳學(xué)中主要作為遺傳變異的物種,利用其變異來(lái)選取更好的材料,用在其他工業(yè)等方面如:發(fā)酵,菌體培養(yǎng),醫(yī)療藥物的提取等。大腸桿菌的存在,使得試驗(yàn)易于操作。4酵母釀酒酵母
特點(diǎn):1)是單細(xì)胞生物,可在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng),可通過(guò)改變物理或化學(xué)環(huán)境完全控制其生長(zhǎng)2)在單倍體和二倍體的狀態(tài)下均可生長(zhǎng),并可在實(shí)驗(yàn)條件下控制單倍體和二倍體之間的相互轉(zhuǎn)換,這對(duì)其基因功能的研究十分有利
3)有將近31%編碼蛋白質(zhì)的基因或ORF與哺乳動(dòng)物編碼蛋白質(zhì)的基因有高度的同源性5線蟲(chóng)
Caenorhabditiselegans特點(diǎn):
1)通身透明,長(zhǎng)不過(guò)1mm。
2)身體中所有細(xì)胞能被逐個(gè)盤點(diǎn)并各歸其類。幼蟲(chóng):556個(gè)體細(xì)胞,2個(gè)原始生殖細(xì)胞。
成蟲(chóng):雌雄同體成蟲(chóng),959個(gè)體細(xì)胞,201*個(gè)生殖細(xì)胞。雄性成蟲(chóng)(偶見(jiàn)):1031個(gè)體細(xì)胞,1000個(gè)生殖細(xì)胞。
3)生命周期短,從生到死僅為三天半,使得不間斷地觀察并追蹤每個(gè)細(xì)胞的演變成為可能。
4)把線蟲(chóng)浸泡到含有核酸的溶液中可實(shí)現(xiàn)基因?qū)搿?果蠅
drosophilamelanogaster
主要用于遺傳和發(fā)育研究。
其特點(diǎn)為:繁殖迅速,染色體巨大,易于進(jìn)行基因定位。
由14個(gè)體節(jié)構(gòu)成的軀干完全對(duì)稱,一套基因控制了這些體節(jié)從上到下的發(fā)生過(guò)程,這套基因普遍存在于從昆蟲(chóng)到人的基因組中,是決定機(jī)體左右對(duì)稱布局形成的最基本因素。7斑馬魚(yú)斑馬魚(yú)特點(diǎn):
1)產(chǎn)卵多,繁殖迅速。
2)胚胎通體透明,是進(jìn)行胚胎發(fā)育機(jī)理和基因組研究的好材料。8小鼠
17世紀(jì)開(kāi)始用于解剖學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn),經(jīng)長(zhǎng)期人工飼養(yǎng)選擇培育,已育成千余個(gè)獨(dú)立的遠(yuǎn)交群和近交系,是生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛使用的模式生物,是當(dāng)今世界上研究最詳盡的哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。1999年,美英幾家大型科研機(jī)構(gòu)成立了老鼠基因組測(cè)序的合作團(tuán)體,201*年8月公布了老鼠基因組物理圖譜的框架,完整的老鼠基因組圖譜于201*年完成。模式生物小鼠的應(yīng)用
轉(zhuǎn)基因小鼠與基因剔除小鼠小鼠突變品系與人類疾病研究
帶有人生長(zhǎng)激素基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(右側(cè)小鼠為轉(zhuǎn)基因小鼠,左側(cè)為正常小鼠)。130
小鼠生理生化和發(fā)育過(guò)程和人類相似性,基因組的高度同源性以及的基因組改造技術(shù)的成熟性,均說(shuō)明利用小鼠建立人類疾病的模型可以真實(shí)模擬人類疾病的發(fā)病過(guò)程及對(duì)藥物的反應(yīng)。因此,利用小鼠等模式動(dòng)物建立的人類疾病模型具有重大理論和運(yùn)用價(jià)值。8擬南芥-“植物中的果蠅”Arabidopsisthaliana
擬南芥的基因組是目前已知植物基因組中最小的。每個(gè)單倍染色體組(n=5)的總長(zhǎng)只有7000萬(wàn)個(gè)堿基對(duì),即只有小麥染色體組長(zhǎng)的1/80,這就使克隆它的有關(guān)基因相對(duì)說(shuō)來(lái)比較容易。擬南芥是自花受粉植物,基因高度純合,用理化因素處理突變率很高,容易獲得各種代謝功能的缺陷型。131
擬南芥的優(yōu)點(diǎn)是植株。1個(gè)茶杯可種植好幾棵)、每代時(shí)間短(從發(fā)芽到開(kāi)花不超過(guò)6周)、結(jié)子多(每棵植物可產(chǎn)很多粒種子)、生活力強(qiáng)(用普通培養(yǎng)基就可作人工培養(yǎng))。模式生物基因組計(jì)劃
模式生物基因組計(jì)劃是人類基因組計(jì)劃的一個(gè)重要組成部分,是人類基因組計(jì)劃的必要補(bǔ)充并對(duì)后者的研究有很大的促進(jìn)作用。
由于人類對(duì)自身理解的限制、實(shí)驗(yàn)的限制和倫理學(xué)的制約,醫(yī)學(xué)、生物學(xué)的研究在很大程度上依賴于對(duì)一些模式生物的研究。在研究人類基因組的同時(shí),平行地進(jìn)行一些微生物、植物、動(dòng)物等模式生物基因組的研究,不僅可為人類基因組研究做方法學(xué)和組織工作的積累,而且通過(guò)將從模式生物中所得到的數(shù)據(jù)和資料與人類基因組進(jìn)行同源性比較,借以闡明人類相應(yīng)基因的功能。因此,一些與人類基因具有相似性,但結(jié)構(gòu)和基因組成都相對(duì)比較簡(jiǎn)單的生物體就成為進(jìn)行人類基因組研究的絕好樣本,即為人類基因組研究提供參照,對(duì)這些模式生物的基因組進(jìn)行測(cè)序和分析,就是模式生物基因組計(jì)劃。
四.請(qǐng)從下列20種方法(A-T)中,挑選一種最佳方法來(lái)探測(cè)下面的10個(gè)問(wèn)題
方法A,X射線衍射,B,SOUTHERN雜交,C,掃描電鏡技術(shù),D,細(xì)胞顯微分光光度計(jì)E,免疫熒光技術(shù),F(xiàn),電鏡超薄切片技術(shù),G,Northern雜交,H,放射自顯影技術(shù)I,核磁共振技術(shù)J,DNA序列分析,K,原位雜交技術(shù)L,Western雜交技術(shù)M,核酸電鏡及核酸異源雙鏈分析技術(shù)N,電鏡負(fù)染色技術(shù)O,細(xì)胞融合技術(shù)P,飽和雜交技術(shù)Q,免疫電鏡技術(shù)R,冷凍蝕刻復(fù)型技術(shù)S,顯微液相技術(shù)T,DNA定點(diǎn)突變技術(shù)
問(wèn)題1粗略估計(jì)某種組織的基因組大概有多少的DNA序列正在轉(zhuǎn)錄mRNA2某種抗癌藥物的作用機(jī)制是阻止腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制還是阻止蛋白質(zhì)合成
3已克隆了雞卵清蛋白的基因,如何證明在雛雞的輸卵管中該基因不轉(zhuǎn)錄而在產(chǎn)卵母雞輸卵管中則活躍地轉(zhuǎn)錄
4已克隆了人的rDNA問(wèn)rDNA分布在人的哪幾條染色體上
5把分離的線粒體置于電場(chǎng)中,問(wèn)電場(chǎng)作用是否會(huì)使線粒體內(nèi)膜上蛋白質(zhì)分布發(fā)生改變6體外培養(yǎng)細(xì)胞,從G1期到S期,細(xì)胞表面形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化
7已提純了某種雙鏈DNA病毒的DNA分子,并克隆了這種病毒的一個(gè)基因,問(wèn)該基因病毒基因組的哪個(gè)部位上
8原代細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層,由于接觸抑制作用DNA合成停止,如何證明9觀察腺病毒核衣殼表面的亞單位-衣粒形態(tài)與排列方式
10研究酵母菌在無(wú)氧和有氧條件下生長(zhǎng)時(shí),其線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化
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