細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

動(dòng)物細(xì)胞融合

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

⒈了解動(dòng)物細(xì)胞融合的常用方法。⒉學(xué)習(xí)化學(xué)融合的基本操作過程。

⒊觀察動(dòng)物細(xì)胞融合過程中細(xì)胞的行為和變化。

【實(shí)驗(yàn)原理】

細(xì)胞融合是指在自發(fā)或者誘導(dǎo)條件下，兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞合并為雙核或者多核細(xì)胞的過程。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有很多方法可以誘導(dǎo)細(xì)胞融合，包括病毒誘導(dǎo)融合、化學(xué)誘導(dǎo)融合和電激誘導(dǎo)融合。

⒈病毒誘導(dǎo)融合

仙臺(tái)病毒、牛痘病毒、新城雞瘟病毒和皰疹病毒等可以介導(dǎo)細(xì)胞的融合。這類病毒的被膜中含有融合蛋白，可介導(dǎo)病毒和宿主細(xì)胞融合，同時(shí)也可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的融合。用紫外線滅活后，這些病毒即可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生融合。

⒉化學(xué)誘導(dǎo)融合

很多化學(xué)試劑能夠誘導(dǎo)細(xì)胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亞砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰絲氨酸等。這些物質(zhì)能夠改變細(xì)胞膜脂質(zhì)分子的排列，在去除這些物質(zhì)之后，細(xì)胞膜趨向于恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)。在恢復(fù)過程中相接觸的細(xì)胞由于接口處脂質(zhì)雙分子層的相互親和與表面張力，細(xì)胞膜融合，胞質(zhì)流通，發(fā)生融合�；瘜W(xué)誘導(dǎo)方法，操作方便，誘導(dǎo)融合的概率比較高，效果穩(wěn)定，適用于動(dòng)、植物細(xì)胞，但對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性。PEG是被廣泛使用的化學(xué)融合劑。

⒊電激誘導(dǎo)融合

包括電誘導(dǎo)、激光誘導(dǎo)等。其中，電誘導(dǎo)是先使細(xì)胞在電場中極化成為偶極子，沿電力線排布成串，再利用高強(qiáng)度、短時(shí)程的電脈沖擊破細(xì)胞膜，細(xì)胞膜的脂質(zhì)分子發(fā)生重排，由于表面張力的作用，兩細(xì)胞發(fā)生融合。電誘導(dǎo)方法具有融合過程易控制、融合概率高、無毒性、作用機(jī)制明確、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。

【實(shí)驗(yàn)用品】

⒈材料

雞血紅細(xì)胞。⒉試劑

50%PEG、Hank’s溶液(pH7.4)、Alsever’s細(xì)胞保存液、0.85%氯化鈉溶液。⒊器材

正置顯微鏡、離心機(jī)、離心管、載玻片、蓋玻片、滴管、注射器等。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

⒈雞血紅細(xì)胞的制備和保存

用無菌注射器先吸入Alsevers溶液1ml，再從雞翼下靜脈取血0.5~1ml，取出后放入刻度離心管中，再加入2~3mlAlsevers溶液，使總量為4~5ml，混勻并封口，置于4℃冰箱內(nèi)。

⒉PEG誘導(dǎo)融合

⑴取保存的雞血，離心去除Alsevers溶液，以0.85%氯化鈉溶液配制成5%~10%的懸液。

⑵稱取1gPEG放入試管內(nèi)，在沸水浴中融化后，加入1ml預(yù)熱的Hank’s溶液，混勻，制成50%的PEG溶液。放入37℃水浴中待用。

⑶取上述雞紅細(xì)胞懸液1ml放入離心管中，再加入5mlHank’s溶液混勻，然后以1000r/min離心5min，小心棄去上清液，用指彈法將細(xì)胞團(tuán)塊彈散。

⑷取上述50%PEG溶液1ml，在1min內(nèi)滴加到雞紅細(xì)胞懸液中，邊加邊輕輕搖動(dòng)混勻。待PEG全部加入后靜置2~5min左右。

第1頁細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

⑸緩慢滴加6mlHank’s溶液以終止PEG的作用，混勻，靜置5min。

⑹1000r/min離心3min，棄上清液后，取一滴融合后的細(xì)胞懸液滴片，加蓋玻片鏡檢。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】

【分析與討論】

⒈結(jié)果分析

視野中有部分細(xì)胞出現(xiàn)融合現(xiàn)象，但是沒有觀察到細(xì)胞核。此外，視野中有些細(xì)胞發(fā)生重疊，是由于稀釋不足造成的。

⒉注意事項(xiàng)

⑴制備的雞血紅細(xì)胞懸液的濃度不宜過高，否則細(xì)胞容易聚集，融合效果受影響。

⑵在離心之前，為了防止損壞儀器，應(yīng)配平離心機(jī)。具體方法為：把相對(duì)的兩個(gè)皮套放在天平上秤，在皮套中央各放置一個(gè)空的離心管，通過調(diào)節(jié)離心管中水的量來使天平達(dá)到平衡。

⑶在制片之前，應(yīng)對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行充分稀釋，以免細(xì)胞發(fā)生重疊，影響觀察。⑷在制片之后，如雞血紅細(xì)胞懸液過多，則應(yīng)用吸水紙吸去，以免弄臟物鏡。⑸為了觀察清楚，應(yīng)把光線調(diào)暗，并改用小光圈。

【相關(guān)鏈接】

細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用

⒈植物體細(xì)胞雜交

植物體細(xì)胞雜交（plantsomatic

hybridization）,又稱原生質(zhì)體融合（Protoplastfusion）是指將植物不同種、屬，甚至科間的原生質(zhì)體通過人工方法誘導(dǎo)融合，然后進(jìn)行離

體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術(shù)。植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，未脫壁的兩個(gè)細(xì)胞是很難融合的，植物細(xì)胞只有在脫去細(xì)胞壁成為原生質(zhì)體后才能融合，所以植物的細(xì)胞融合也稱為原生質(zhì)體融合。

⒉單克隆抗體

單克隆抗體是由淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的、只針對(duì)復(fù)合抗原分子上某一單個(gè)抗原決定簇的特異性抗體。淋巴細(xì)胞雜交瘤是用人工方法使骨髓瘤細(xì)胞（純系小鼠的腹水瘤型漿細(xì)胞）與已用抗原致敏并能分泌某種

第2頁細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

抗體的淋巴細(xì)胞（常用致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞，起作用的是其中的B細(xì)胞）融合而成的。用來使上述淋巴細(xì)胞致敏的抗原有人和動(dòng)物的T細(xì)胞、B細(xì)胞、紅細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、各種微生物或其他抗原物質(zhì)等。這種融合細(xì)胞既具有腫瘤細(xì)胞能大量、無限繁殖的特性，又具有B細(xì)胞能合成分泌特異性抗體的能力。由于一個(gè)B細(xì)胞克隆只針對(duì)一個(gè)

抗原決定簇產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的抗體，所以一個(gè)B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而成的單個(gè)雜交瘤細(xì)胞，也只產(chǎn)生某種單一的抗體。采用適當(dāng)方法把雜交瘤細(xì)胞分離出來，進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，使之大量繁殖，則在該培養(yǎng)液中增殖而形成的細(xì)胞克隆，只產(chǎn)生完全均一的、單一特異性的抗體，即單克隆抗體。若把能產(chǎn)生特異性抗體的單克隆雜交瘤進(jìn)行大量培養(yǎng)，或注入原系動(dòng)物腹腔中，則雜交瘤仍以腹水型方式生長，在培養(yǎng)液或腹水中會(huì)含有大量單克隆抗體。用雜交瘤技術(shù)制備出來的單克隆抗體純度高、專一性強(qiáng)、效價(jià)高，使用時(shí)可免除不同細(xì)胞及微生物種或株間血清學(xué)上的交叉反應(yīng)，大大提高了診斷的特異性及敏感性。另外，在研究細(xì)胞表面標(biāo)志、提純可溶性抗原、進(jìn)一步研究抗體的結(jié)構(gòu)和功能等方面都起著十分重要的作用。

⒊細(xì)胞治療

將自體細(xì)胞取出，經(jīng)培養(yǎng)3-5周后再移植（注射）到自體的病患部位，達(dá)到替代受損細(xì)胞修復(fù)之目的，細(xì)胞治療有長期的效果，細(xì)胞能釋放自身的愈合和再生能力，治療疾病（腫瘤；臟器；器官；疤痕；皺紋;皮膚化等）。

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⒋核移植

核移植是將供體細(xì)胞核移入去核的卵母細(xì)胞中，使后者不經(jīng)精子穿透等有性過程即可被激活、分裂并發(fā)育，讓核供體的基因得到完全復(fù)制。培養(yǎng)一段時(shí)間后，在把發(fā)育中的卵母細(xì)胞移植到人或動(dòng)

物體內(nèi)的方法。核移植的細(xì)胞來源主要分為：供體細(xì)胞來源和受體細(xì)胞的來源兩種。核移植主要用于細(xì)胞移植和異種器官移植，細(xì)胞移植可以治療由于細(xì)胞功能缺陷所引的各種疾病。

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實(shí)驗(yàn)六細(xì)胞膜的滲透性

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解細(xì)胞膜[1]的滲透性及各類物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度[2]

二、實(shí)驗(yàn)原理

1、在等滲溶液中，細(xì)胞對(duì)各種溶質(zhì)的透過性不同。有的溶質(zhì)可以進(jìn)

入，有的溶質(zhì)不能滲入。

2、滲入的溶質(zhì)能提高細(xì)胞的滲透壓，促進(jìn)水分子進(jìn)入細(xì)胞，引起溶

血現(xiàn)象[3]。

3、不同的溶質(zhì)滲入到細(xì)胞內(nèi)的速度不同，因此溶血時(shí)間也不同。

三、實(shí)驗(yàn)材料

新鮮血液（雞血、豬血、牛血等）

四、實(shí)驗(yàn)器材

試管（1.5cmX18cm）、試管架、10ml移液管、1ml移液管、200ml燒杯（2個(gè)）、250ml容量瓶、移液槍、膠頭滴管、菜刀、吸球、電子天平、顯微鏡、蓋玻片、載玻片、秒表

五、實(shí)驗(yàn)藥品及試劑0.17MNaCl、0.17MNH4Cl、0.17MNH4Ac、0.17MNaNO3、0.12MNa2SO4、0.12M草酸銨、0.32M葡萄糖、0.32M甘油、0.32M乙醇、0.32M丙酮、肝素抗凝劑[4]

六、實(shí)驗(yàn)步驟1、制備血液稀釋液

（1）抗凝劑的制備：首先稱取1克肝素鈉粉末，然后加入0.17M

NaCl溶液10ml（1∶10的比例），混合均勻，制成肝素抗凝劑。

（2）血液稀釋液的制備：取新鮮血液，按比例（肝素抗凝劑:血液

=1∶10）混合均勻，配制成經(jīng)肝素抗凝的血液[5][6]。

（3）按比例（經(jīng)肝素抗凝的血液∶0.17MNaCl溶液=1∶10）混

合均勻，形成一種不透明的紅色液體[7]。

2、低滲溶液（空白對(duì)照）的觀察

取試管一只，加入10ml蒸餾水，然后再加入1ml稀釋的血液。注意觀察溶液顏色的變化。結(jié)果是溶液由不透明的紅色變?yōu)槌吻濉Ｓ涗浵逻@個(gè)過程所要的時(shí)間。3、紅血球的滲透性

按表一的配制，分別在下列十種等滲溶液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。輕輕搖動(dòng)，注意有無顏色變化，是否有溶血現(xiàn)象發(fā)生，記下時(shí)間（自加入稀釋血液到溶液逐漸由紅色變?yōu)橥该鞒吻�，紅血球全部溶血所需時(shí)間），填入表一的空格中。4、顯微觀察

[1]何為細(xì)胞膜？[5]注意：這一步，動(dòng)作要非常迅速，否則雞血會(huì)凝固�；蛘呦劝芽鼓齽┘尤氲綗�杯中，再加入新鮮的[2]雞血，邊加邊震蕩即可。為何不同物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度不同？[6]為什么新鮮的雞血會(huì)凝固？[3]何為溶血現(xiàn)象？[7]為什么這一步要使用0.17M的NaCl溶液？[4]你知道有哪些血液抗凝劑？（1）血液紅細(xì)胞的觀察

滴一滴稀釋的血液于載玻片上，蓋上蓋玻片。用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的種類、形狀和顏色。

（2）細(xì)胞破碎的觀察

在上一步的載玻片的一端滴加清水，在另一端吸水，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞的破裂。

七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

1、比較和分析你所觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并解釋原因。

結(jié)果：

（1）在所提供的試劑中不溶血的有：

（2）在所提供的試劑中不完全溶血的有：（3）在所提供的試劑中完全溶血的有：結(jié)果分析與比較：結(jié)論：

2、繪制你所觀察到的血液細(xì)胞圖。

3、討論溶血實(shí)驗(yàn)在研究中應(yīng)用的可能性。附1：試劑配制表

1、0.17MNaCl需要＿＿＿＿＿＿克NaCl，定容至100ml。2、0.17MNH4Cl需要＿＿＿＿＿＿克NH4Cl，定容至100ml。3、0.17MNH4Ac需要＿＿＿＿＿＿克NH4Ac，定容至100ml。4、0.17MNaNO3需要＿＿＿＿＿＿克NaNO3，定容至100ml。5、0.12MNa2SO4需要＿＿＿＿＿＿克Na2SO4，定容至100ml。6、0.12M草酸銨需要＿＿＿＿＿＿克草酸銨，定容至100ml。7、0.32M葡萄糖需要＿＿＿＿＿＿克葡萄糖，定容至100ml。8、0.32M甘油需要＿＿＿＿＿＿克甘油（100%），定容至250ml。9、0.32M乙醇需要＿＿＿＿＿＿克無水乙醇，定容至250ml。10、0.32M丙酮需要＿＿＿＿＿＿克丙酮，定容至250ml。

附2：表一在不同低滲溶液下溶血現(xiàn)象的調(diào)查

編號(hào)12345678910試劑10ml0.17MNaCl+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNH4Cl+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNH4Ac+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNaNO3+1ml稀釋的雞血10ml0.12MNa2SO4+1ml稀釋的雞血10ml0.12M草酸銨+1ml稀釋的雞血10ml0.32M葡萄糖+1ml稀釋的雞血10ml0.32M甘油+1ml稀釋的雞血10ml0.32M乙醇+1ml稀釋的雞血10ml0.32M丙酮+1ml稀釋的雞血是否溶血時(shí)間

附3：溶血結(jié)果的判斷

（1）不溶血：液體分2層，上層淺黃色透明，下層紅色不透明，鏡檢紅細(xì)胞完好。（2）不完全溶血：溶液混濁，上層變紅色，鏡檢有部分紅細(xì)胞破裂。（3）完全溶血：液體變紅而且透明，鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全成碎片。

附4：細(xì)胞膜內(nèi)外物質(zhì)交換示意圖

原始生命向細(xì)胞進(jìn)化所獲得的重要形態(tài)特征之一，是生命物質(zhì)外面出現(xiàn)了一層膜性結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞膜。細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)總稱為生物膜(biomembrane)。

細(xì)胞膜(cellmembrane)，又稱原生質(zhì)膜，是細(xì)胞結(jié)構(gòu)中分隔細(xì)胞內(nèi)、外不同介質(zhì)和組成成分的界面。其厚度通常為7～8nm，由脂類和蛋白質(zhì)組成。一般蛋白質(zhì)占60%-80%，類脂占20%-40%，碳水化合物約占5%。關(guān)于細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)模型，流體鑲嵌模型是目前被最廣泛接受和認(rèn)可的觀點(diǎn)。該模型由美國加州大學(xué)的辛格(S.J.Singer)和尼克森(G.L.Nicolson)于1972年提出。該模型突出了膜的流動(dòng)性和不對(duì)稱性，其結(jié)構(gòu)特征是：生物膜的骨架是磷脂雙分子層，其中磷脂分子的疏水性尾部相對(duì)，極性頭部朝向水相。蛋白質(zhì)或嵌在脂雙層表面，或嵌在其內(nèi)部，或橫跨整個(gè)脂雙層，表現(xiàn)出分布的不對(duì)稱性。根據(jù)在膜上的位置不同，膜蛋白可分為兩類：通過強(qiáng)疏水或親水作用同膜脂牢固結(jié)合不易分開的，稱為整合蛋白(integralprotein)或內(nèi)在蛋白；附著在膜表層，與膜結(jié)合比較疏松容易分離的，稱為外周蛋白(peripheralprotein)。細(xì)胞膜的表面還有糖類分子，形成糖脂、糖蛋白。因脂雙層具有流動(dòng)性，故蛋白質(zhì)分子也可以在脂雙層中橫向移動(dòng)；又因膜的內(nèi)外表面上脂類和蛋白質(zhì)的分布不均勻，反映了膜兩側(cè)的功能不同。

細(xì)胞膜是細(xì)胞與周圍環(huán)境和細(xì)胞與細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要通道。其最重要的特性是半透性，或稱選擇透過性，對(duì)進(jìn)出入細(xì)胞的物質(zhì)有很強(qiáng)的選擇透過性。這是細(xì)胞膜最基本的一種功能，如果喪失了這種功能，細(xì)胞就會(huì)死亡。細(xì)胞膜的功能有：

1)分隔形成細(xì)胞和細(xì)胞器，為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，膜的面積大大

增加，提高了發(fā)生在膜上的生物功能；

2)屏障作用，膜兩側(cè)的水溶性物質(zhì)不能自由通過；3)選擇性物質(zhì)運(yùn)輸，伴隨著能量的傳遞；

4)生物功能：激素作用、酶促反應(yīng)、細(xì)胞識(shí)別、電子傳遞等；5)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能：細(xì)胞與周圍環(huán)境之間的物質(zhì)交換，是通過細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)功能實(shí)現(xiàn)的，其主要轉(zhuǎn)運(yùn)方式有四種，即單純擴(kuò)散、易化擴(kuò)散、主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、入胞和出胞作用。6)細(xì)胞膜的受體功能：受體是細(xì)胞識(shí)別和結(jié)合化學(xué)信息的特殊結(jié)構(gòu)，其本質(zhì)是蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)八細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握細(xì)胞融合原理、應(yīng)用PEG融合細(xì)胞的方法以及細(xì)胞融合率的計(jì)算。實(shí)驗(yàn)用品

1.材料雞紅細(xì)胞

2.器材和儀器普通光學(xué)顯微鏡、普通低速離心機(jī)、恒溫水浴箱、刻度離心管、試管、載玻片、蓋玻片

3.試劑50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)、生理鹽水實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

一、原理

細(xì)胞融合(Cellfusion)，即在自然條件下或用人工方法(生物的、物理的、化學(xué)的)使兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的過程。人工誘導(dǎo)的細(xì)胞融合，在六十年代作為一門新興技術(shù)而發(fā)展起來。由于它不僅能產(chǎn)生同種細(xì)胞融合，也能產(chǎn)生種間細(xì)胞的融合，因此細(xì)胞融合技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。

細(xì)胞融合的誘導(dǎo)物種類很多．常用的主要有滅活的仙臺(tái)病毒(Sendaivirus)，聚乙二醇

(Polyethyleneglycol，PEG)和電脈沖。目前應(yīng)用最廣泛的是聚乙二醇，因?yàn)樗�易得、簡便，且融合效果穩(wěn)定。PEG的促融機(jī)制尚不完全清楚，它可能引起細(xì)胞膜中磷脂的酰鍵及極性基團(tuán)發(fā)生結(jié)構(gòu)重排。二、方法

1.取新鮮雞血以0.85％生理鹽水制成10％的懸液。2.稱取0.5克PEG(MW=4,000)放入試管內(nèi)，在酒精燈上融化之，迅速加入0.5ml預(yù)熱的37℃Hanks液混勻制成50％的PEG溶液。放入37℃水浴中備用。

3.取上述10％的雞紅細(xì)胞懸液1ml放入離心管中，沿離心管壁滴加50％PEG溶液，邊加邊晃動(dòng)試管使之混勻，37℃水浴20min。

4.取出離心管，緩慢滴加9mlHanks液以終止PEG的作用，800g離心3min，棄上清。5.用貼壁的液體重懸細(xì)胞，取一滴制成滴片，加蓋片鏡檢。結(jié)果：在高倍鏡下可以看到有兩個(gè)或兩個(gè)以上的雞紅細(xì)胞膜融合在一起，形成一個(gè)異核體細(xì)胞。要注意辨別融合細(xì)胞與重疊的雞紅細(xì)胞。三、融合率的計(jì)算

在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞(包括融合的與未融合的細(xì)胞)，以融合細(xì)胞(含兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞核的細(xì)胞)的細(xì)胞核數(shù)除以總細(xì)胞核數(shù)(包括融合與未融合的細(xì)胞核)即得出融合率。公式如下：

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